论文部分内容阅读
本文首先以调控中心代谢途径通量为代谢工程策略,研究了戊糖磷酸途径和糖异生途径中关键酶基因扰动对枯草芽孢杆菌核黄素合成的影响;其次,利用454 GS FLX高通量测序系统测定了核黄素生产菌B.subtilis 24和B.subtilis RH33的基因组,实现了基于全基因组的突变分析和分类,并构建了用于突变分析和菌株重构的技术平台。利用定点突变技术改造C.glutaminum的zwf和gnd基因,得到解除变构抑制作用的编码酶基因zwf243和gnd361。分别表达zwf243和gnd361时能够显著提高B.subtilis RH33核黄素的合成,核黄素摇瓶产量分别达到4.66g/L和4.82g/L,提高了18.0%和22.0%。两突变基因同时表达时,核黄素摇瓶产量为5.17g/L,葡萄糖限制补料培养核黄素产量为15.7g/L,分别提高了30.9%和39%。基于LC-MS的胞内代谢物谱分析表明,工程菌胞内戊糖磷酸途径代谢物如核黄素及其前体物AIR、DRL和Ru5P浓度均比宿主菌显著增加,提高了15%-46%;相反,三羧酸循环和糖酵解途径中的代谢物浓度比工程菌降低。构建了糖异生途径关键酶基因pckA、gapB和fbp整合型表达载体pUC18-TPA,pUC18-NPB,pUC18-SPF以及fbp与gapB共表达载体pUC18-PFB和fbp,gapB与pckA共表达载体pUC18-PFBA。以葡萄糖为碳源的摇瓶发酵结果表明,fbp基因的过表达对核黄素的合成影响最大,核黄素产量达到4.73g/L,提高18%左右;关键酶基因共表达核黄素发酵结果表明,fbp和gapB基因共表达对核黄素的合成影响最大,产量提高22%左右,达到4.89g/L。利用Roche 454 GS FLX系统测定了核黄素生产菌B.subtilis 24和B.subtilis RH33基因组,平均读长分别为388bp和394bp,覆盖率高达48倍和46倍;结合Sanger法测序补齐缺口,组装全基因组,B.subtilis24和B.subtilis RH33的全基因组的大小分别为4194978bp和4195221bp,G+C含量均为43.55%。全基因组的突变分析表明,B.subtilis 24中含有突变512个,其中插入突变29个,缺失突变20个,替代突变463个;B.subtilis RH33中含有突变549个,其中插入突变31个,缺失突变24个,替代突变494个;两基因组的比对分析结果表明,B.subtilis 24和B.subtilis RH33共有的突变468个,而B.subtilis 24独有的突变44个,B.subtilis RH33独有的突变81个。本文对突变进行了注释,根据突变基因在代谢途径中的功能进行分类,并确定了突变分析验证的原则。利用upp基因作为负筛选标记,建立了枯草芽孢杆菌菌株重构系统。