家蚕是一种重要的经过人工驯化的经济昆虫,目前被认为是理想的研究鳞翅目昆虫的模式生物。蚕丝产业作为我国具有五千多年悠久历史的传统产业,从古至今在社会经济文化生活中占有重要地位。同时蚕丝作为一种具有优良力学性能和稳定生物包容性的生物材料,在我们生活中的应用越来越广泛,关于丝纤维性能方面的研究也颇受关注。丝腺作为丝蛋白合成及分泌的场所,在丝纤维形成的过程中,丝蛋白从后部丝腺和中部丝腺合成并转运到前部丝腺后,伴随着金属离子浓度的变化、丝腺p H值的降低以及剪切力的作用,丝蛋白由溶胶状态逐渐转变为凝胶状。体外研究表明,这种转化过程与家蚕丝腺不同区段p H值的变化密切相关。有研究证明家蚕中空泡型ATP酶(Vacuolar-type ATPase,V-ATPase)与丝腺的酸化过程有关。因此目前认为,丝腺中的V-ATPase介导了丝腺内p H值的降低,丝蛋白纤维化。V-ATPase是多亚基复合酶,包含V1和V0两个亚单位,共14个亚基。V-ATPase参与多种重要的细胞内功能,如细胞酸化、受体介导的内吞作用、翻译后转运以及某些特定的细胞器与质膜的融合等。V-ATPase的每种亚基对于全酶行使功能都是缺一不可的。其作为一种氢离子转运酶,通过转运氢离子从而间接的影响p H环境。近来有研究报道,V-ATPase在家蚕抵御病毒感染的过程中有不可或缺的作用。虽然目前已经发现V-ATPase可以调控丝腺中的p H值,从而影响丝纤维形成,但是这一过程的具体细节尚不清楚。并且,家蚕丝腺中的V-ATPase、p H与丝蛋白力学性能的关系仍然未知。为了更清楚的阐明家蚕V-ATPase在丝纤维形成过程中的作用,本研究选取Bm V-ATPase A亚基和Bm V-ATPase B亚基进行研究:对这两个基因进行了克隆并通过原核表达系统表达了这两个蛋白;对Bm V-ATPase B亚基制备了多克隆抗体,并且利用制备的多克隆抗体对Bm V-ATPase B亚基在丝腺的表达特征进行分析;在细胞水平通过瞬时干涉和抑制剂处理,探索了Bm V-ATPase对细胞周期的影响;最后通过对家蚕进行V-ATPase抑制剂的注射验证V-ATPase对蚕丝纤维性能的影响。获得的主要研究结果如下:1、Bm V-ATPase A、B亚基的克隆、原核表达、纯化及Bm V-ATPase B亚基多克隆抗体的制备从家蚕五龄第3天中肠的c DNA中扩增得到Bm V-ATPase A亚基、Bm V-ATPase B亚基的基因片段。将目的基因进行TA克隆,获得含有目的片段的重组质粒。进一步成功构建了原核表达载体。将重组载体转化入在Transetta(DE3)原核表达菌株中,利用IPTG诱导重组蛋白的表达,发现两个蛋白均在37℃诱导的条件下以包涵体形式表达。对重组蛋白进行质谱鉴定验证后,利用镍柱亲和层析和切胶电洗脱的方法对重组蛋白进行了纯化,并将获得的重组蛋白免疫兔子制备了效价较高,特异性较好的多克隆抗体。2、Bm V-ATPase B亚基的表达特征分析由于V-ATPase是由各个亚基构成的复合体,各个亚基的表达模式与全酶相同。因此,本部分以Bm V-ATPase B亚基为靶标,对整个V-ATPase的表达特性进行了分析。利用Western blotting对Bm V-ATPase B亚基在丝腺中的表达特征进行分析,发现其在前部丝腺表达量最高。通过对家蚕丝腺进行免疫荧光定位,初步发现Bm V-ATPase B亚基蛋白定位于丝腺细胞层。通过激光共聚焦显微镜进一步进行免疫荧光定位,发现Bm V-ATPase B亚基蛋白主要定位于细胞膜上。3、Bm V-ATPase对细胞周期的影响本部分在细胞水平上对Bm V-ATPase调控细胞周期的功能进行了初探。首先通过合成双链RNA,成功地对细胞中Bm V-ATPase A、B亚基基因进行瞬时干涉,结果发现干涉后促进了细胞由G1期向S期的转换。另一方面在细胞中加入V-ATPase的特异性抑制剂巴弗洛霉素A1,与双链RNA瞬时干涉的结果一致,将V-ATPase的活性抑后也可促进细胞周期G1期向S期的转换。这些结果说明V-ATPase可以影响细胞的增殖和分裂。4、V-ATPase在茧丝形成过程中的功能初探对上蔟期家蚕注射V-ATPase抑制剂,注射后观察茧型及茧丝的直径,发现注射抑制剂后部分茧型变为不规则型;将茧壳进行缫丝处理获得茧丝,利用电镜测量茧丝直径,发现注射抑制剂后茧丝直径变粗;利用红外光谱测定丝纤维的二级结构,发现注射抑制剂后,丝纤维的二级结构中β折叠减少,α螺旋增加;检测茧丝力学性能,发现茧丝韧性和延展性增加,强度降低。这些结果证明V-ATPase可以影响丝纤维的二级结构和力学性能。