红牛膝,为四川凉山彝族自治州、云南楚雄彝族自治州、贵州等彝族地区的彝医临床常用药材,在凉山彝族自治州,称为勒补或乃补(),为苋科植物头花杯苋Cyathula capitata(Wall.)Moq.的根,用于治疗跌打损伤、风湿、类风湿等疾病。同时,红牛膝是彝医经典验方“我思”中的主要药材之一,“我思”为四川省非物质文化遗产“彝医药”传承人——阿子阿越(郝应芬),根据阿子家族传承经验,结合自己三十余年的彝医临床经验,精心研制成的彝医经典验方,彝药“我思”在治疗彝医临床上“斯色”病(痛风性关节炎)治愈率高、复发性小,并且具有标本兼治的疗效。国内外对牛膝类药材的研究主要集中在中医临床上常用的牛膝Achyranthes bidentata Blume与川牛膝Cyathula officinalis Kuan;红牛膝的相关研究较少。红牛膝作为四川凉山彝族自治州、云南楚雄彝族自治州、贵州等彝族地区的彝医临床常用药材,目前尚未建立药材和成方制剂的质量标准,影响红牛膝药材临床应用的安全、有效和质量可控。因此,本课题拟从彝医药典籍考证、生药学、抗氧化活性、药材质量标准(草案)制定等方面进行研究,以期为红牛膝彝药材资源的保护、医疗机构制剂开发和质量控制提供科学参考和依据,主要研究内容如下:(1)根据彝药材名称“红牛膝”在各彝医医疗机构收集药材样品、采集原植物标本和文献查阅,开展了彝药材“红牛膝”的原植物定种和彝医临床使用情况调查研究,试验结果表明:1)西昌市彝医药研究所提供的药材勒补,原植物为头花杯苋(麻牛膝)Cyathula capitata(Wall.)Moq.,以根入药,彝医临床配伍其他药材使用,治疗痛风性关节炎、寒湿性骨关节炎、风湿类关节炎、类风湿性关节炎等疾病。2)贵州地区所用红牛膝为苋科植物柳叶牛膝Achyranthes longifolia(Makino)Makino,以根入药,生用,破血利湿,用于治疗经闭、月经不通等;熟用,补益肝肾、强壮筋骨,用于治疗肝肾虚损、腰膝疼痛等。3)云南彝区所用红牛膝来源广泛,包括牛膝、牛膝野生种、粗毛牛膝、钝叶土牛膝和柳叶牛膝等,鲜用或炮制后使用,具有活血祛瘀、清火解毒、除湿止痛的功效,治跌打淤痛、月经不调、咽喉肿痛、手足麻木等。4)红牛膝主要应用于少数民族地区,暂未查阅到有关红牛膝配伍入药的成方制剂收载品种。5)凉山彝族地区用红牛膝配伍的彝药“我思”在凉山彝族地区具有较长的用药历史,具有治愈率高、复发性小,并且具有标本兼治的疗效,红牛膝作为方中主要药材之一,有必要进行更加深入的研究。(2)红牛膝原植物、性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别、水分、灰分、浸出物等含量测定研究,试验结果表明:1)新鲜根表皮红色或断面红色或黄色特征明显,根显微特征中有异形维管束;6批红牛膝药材的水分在7.70-9.69%之间,平均为8.82%;2)总灰分在6.33-7.34%之间,平均值为6.79%;酸不溶性灰分0.40-0.63%之间,平均值为0.51%;3)水溶性浸出物含量在48.52-59.58%之间,平均为53.39%。(3)采用系统预试验法,初步确定红牛膝中所含的大类成分,试验结果表明:红牛膝可能含有糖类、苷类、蛋白质、皂苷、酚类、有机酸、黄酮类、生物碱、甾体、三萜类。(4)通过单因素试验考察乙醇体积分数、提取温度、提取时间、液料比对红牛膝总皂苷提取率的影响,并采用正交试验设计优化总皂苷的提取条件,试验结果表明:红牛膝中总皂苷最佳提取工艺为80%乙醇为溶剂,90℃提取60 min,液料比为20:1;比较红牛膝药材中总皂苷含量,雅安天全县采集样品含量最低,为7.98±0.34 mg.g-1,其余5批样品含量较为接近,均在17-22 mg.g-1之间;样品中总皂苷含量随储存年限增长而有所降低;天全县所采集得样品总皂苷含量与其它批次样品差别较大,因此,该品种可能是川牛膝与麻牛膝的杂交品。(5)通过单因素试验考察超声时间、浸提温度、液料比和醇沉浓度等因素对红牛膝总多糖得率的影响,并通过正交试验设计优化总多糖的超声辅助提取工艺,红牛膝粗多糖的最佳提取工艺为:液料比为40:1,50℃条件下超声提取80 min,最优条件下,红牛膝中粗多糖得率为10.51%,纯度为56.9%。(6)对红牛膝粗提物的体外抗氧化能力进行了评价,试验结果表明:红牛膝粗多糖和粗皂苷均具有一定的抗氧化能力,其清除DPPH自由基及ABTS+自由基的IC50值分别为0.468 mg.mL-1、0.288 mg.mL-1和0.231 mg.mL-1、0.163mg.mL-1;在测定浓度范围内,二者均表现出一定的总还原能力。(7)采用硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶色谱等方法对红牛膝80%乙醇(mL·mL-1)提取物进行分离纯化,分离并鉴定4个化合物,分别为β-谷甾醇、3-O-[α-L-吡喃鼠李糖(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸、牛膝皂苷Ⅰ和牛膝皂苷Ⅱ,均为首次在红牛膝中分离得到。(8)建立同时测定红牛膝中两种皂苷类成分的UPLC方法,比较了不同批次红牛膝药材中两种皂苷的含量。色谱柱:ACQUITY UPLC HSS C18(2.1×50mm,1.7μm);流动相组成:乙腈-0.1%磷酸水,流速:0.2 mL.min-1;线性梯度洗脱;检测波长:210 nm;柱温:40℃,试验结果表明:3-O-[α-L-吡喃鼠李糖(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸和牛膝皂苷Ⅰ在0.1005~1.206 mg.mL-1和0.101~1.212 mg.mL-1范围内与峰面积线性关系良好,牛膝皂苷Ⅰ能很好地反应红牛膝药材中总皂苷的含量。(9)根据以上试验结果,拟定红牛膝药材标准(草案),对红牛膝药材质量进行了规范和控制。