佛手为芸香科柑橘属植物佛手(Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle)的干燥成熟果实,具有疏肝理气,和胃止痛,燥湿化痰等功效。主要分布于热带和亚热带地区,我国浙江、福建、广东、广西和四川等地均有栽培。其中产于广东、广西的佛手称为“广佛手”,相比之下,广佛手具有生长快、果形大、品质好和产量高的特点。近年来黄龙病侵染严重降低了广佛手的产量及质量,重者致树体死亡。本研究建立了鉴定广佛手黄龙病的方法,分析了黄龙病侵染对广佛手不同器官生理生化的影响,并初步探讨了其机制,为广佛手黄龙病的鉴定以及病果的使用提供了理论依据,对于广佛手黄龙病的防控具有一定的借鉴意义。具体研究内容与结果如下:1.被黄龙病侵染的广佛手叶片呈现斑驳型黄化,其果实相对较小,甚至畸形,无“红鼻子果”现象。感病组叶片的PCR产物有1160 bp的特异性条带,并且该条带可以被Xba I酶切成520 bp和640 bp,进而可以判断本研究样品所携带的病菌为黄龙病菌亚洲种。感病组的qPCR图谱既有扩增曲线、熔解曲线跟熔解峰,又有一定的Ct值,而正常组没有扩增。总之,性状分析可以在田间初步判别黄龙病,PCR及qPCR检测能进一步确定佛手黄龙病,且qPCR检测更加灵敏,还可以定量。2.通过测定广佛手不同器官淀粉、蔗糖、果糖和葡萄糖的含量发现,黄龙病侵染对广佛手不同器官糖代谢的影响有所不同。感病组广佛手叶、茎的淀粉含量和叶中各可溶性糖(蔗糖、果糖和葡萄糖)含量极显著性增加,感病组果实的淀粉、果糖和茎中各可溶性糖含量均显著性降低,叶、茎可溶性糖与淀粉比值均极显著性降低。结果表明黄龙病侵染不仅影响了植株的糖代谢,还影响了其正常的生命活动,降低了植株抵御外界不良环境的能力。3.通过测定广佛手叶绿素含量及不同器官MDA含量和各种防御酶活性发现,黄龙病侵染使其叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量极显著性降低(P<0.01),从而影响寄主的光合作用,降低了寄主的抗性;MDA含量的提高表明黄龙病对寄主细胞具有破坏作用,相关防御酶活性的增加表明黄龙病入侵激发了寄主体内的抗性反应。4.通过测定广佛手中柚皮苷、橙皮苷、5,7-二甲氧基香豆素和总黄酮含量发现,黄龙病侵染使其柚皮苷和橙皮苷含量极显著性升高(P<0.01),而5,7-二甲氧基香豆素含量无显著性变化。正常组的各样品相似度差异较小,而感病组的各样品相似度差异较大。黄龙病侵染使广佛手总黄酮含量显著性高于正常组(P<0.05),这可能与黄龙病侵染导致植株激素代谢紊乱有关。5.转录组测序发现,叶中差异表达基因最多,且大多数为下调基因;茎和果实中差异表达基因大多数为上调基因,且茎中差异表达基因数量高于果实。其数量与植株受到黄龙病菌侵染后生理生化改变的程度具有一致性。数据库分析发现,与防御反应、生长发育相关的差异表达基因显著性富集,研究结果与感病植株防御酶活性增加相一致;与碳水化合物(淀粉和蔗糖等)、无机离子运输与代谢相关的差异表达基因所占比例较高,这与被黄龙侵染的植株糖代谢紊乱相一致。6.基于转录组数据,成功克隆了4条广佛手蔗糖转化酶基因,构建其原核表达载体,并在体外成功表达了蛋白,推测CmNIs蛋白均为不稳定亲水性蛋白,分子质量为62.21～72.07 kDa,并预测了蛋白质的二级和三级结构。还分析了黄龙病侵染对广佛手不同器官及不同CmNIs基因相对表达量的影响,发现CmNI2和CmNI3基因在感病组的叶及茎中的相对表达量显著性上调,而CmNI4在感病组茎中的相对表达量却极显著性降低,仅为正常组的27%。