甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding Iectin，MBL）属于哺乳动物C型凝集素超家族中胶凝素家族成员，在血清中多以寡聚体形式存在，一般认为四聚体以上的高寡聚体才具有生物学活性。MBL通过其糖识别域（carbohydrate-recognition domain，CRD）识别病原体表面以甘露糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺等为末端糖基的糖结构，业已证明其能结合A组乙型链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌，奈氏脑膜炎球菌、肺炎衣原体、甲型流感病毒、HIV、白色念珠菌、小球隐孢子虫等多种病原体，激活凝集素补体途径并介导调理吞噬作用，发挥抗感染天然免疫效应。因此，MBL被认为是天然免疫系统中重要的模式识别分子之一。 血清MBL水平低下和功能缺陷与多种病原体反复感染、妇女习惯性流产、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮和类风湿关节炎等疾病相关，引起MBL缺陷的主要原因是MBL基因的点突变。已发现，位于MBL结构基因主要的3个点突变可引起MBL缺陷，它们分别是CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA，均位于MBL基因外显子1，这3个点突变为常染色体显性遗传，其相应的基因型分别为D、B、C型，而野生型为A型。在普通人群中，MBL基因突变的频率非常高，MBL缺陷成为最常见的免疫缺陷病之一，由此MBL补充治疗也呼之欲出。血浆纯化的天然MBL补充治疗已有文献报道，并且已通过了临床一期试验，结果喜人。但存在的问题是人血浆中MBL含量极低，提取的成本过高，来源受限于血液供应，同时避免不了一般血制品的缺点如潜在的HCV、HIV等病毒污染。此外，应用于科研时由于血液成分复杂，难于提取高纯度MBL，使得对MBL生物功能的研究难度加大。因此，体外制备大量与天然MBL结构功能相近的重组蛋白意义重大，研究MBL基因表达的调控亦显同样重要。 本课题组曾克隆了我国汉族人MBL的cDNA即MBL的编码序列，并在哺乳细胞中进行了该基因的表达研究，但表达效率和所表达蛋白的寡聚体组分尚欠满意。鉴于基因内含子等非编码序列对蛋白表达有调节作用，本实验尝试体外表达MBL全长基因。 1.汉族人MBL全长基因的克隆和序列分析; 采用mannan包被以捕获血清MBL、以抗人MBL抗体（HY13131-11）检测的ELISA体系检测血清MBL水平。血样来自8例无反复感染病史和自身免疫病病史的成年健康汉族人个体，每样本按1：2、1：4、1：8稀释，每稀释度3复孔进行检测，检测结果应用SPSS13.0软件按两因素多水平重复测量方法进行统计分析，筛选出血清MBL水平较高的血样用于提取白细胞基因组DNA。以其为模板，设计引物，应用Platinum Taq酶进行高保真PCR扩增MBL全长基因，并采用用pCR（）-XL-TOPO载体进行TA克隆，构建了质粒pXL-MBL。小量提取质粒经酶切、PCR鉴定后送Invitrogen公司测序。ELISA结果显示OD450nm值随稀释度的增加而递减（F=99.351，P<0.001），说明检测体系是可靠的，不同样本间OD450nm值有显著差异（F=27.468，P<0.001）。选择OD450nm值较高的样本用于提取白细胞基因组DNA，扩增MBL全长基因并克隆化。测序结果表明，MBL基因反向插入pCR（）-XL-TOPO，全长6321bp，与GenBank收录的基因序列（NC_000010.9 Region：54195146～54201466）比较，有17个碱基不同：其中仅1个位于编码区（外显子4），即MBL基因的第3195位碱基，导致第126位密码子改变（CTC→CTG），但它们的编码产物均为亮氨酸，且该位置碱基恰与GenBank收录的人MBL cDNA（AH006353）一致；其它不一致的碱基均位于内含子或外显子的非编码区。这说明我们成功克隆了A型MBL基因全长，构建了重组质粒pXL-MBL。 2.MBL基因真核表达质粒的构建; 根据pXL-MBL、pcDNA3.1（-）和pCI-neo的不同酶切谱，采用不同的内切酶，构建MBL基因重组真核表达质粒。 （1）pcDNA3.1（-）-MBL的构建：用KpnⅠ和NotⅠ分别双酶切载体pcDNA3.1（-）和质粒pXL-MBL，凝胶回收载体片段和目的基因片段，用T4 ligase进行连接反应，产物转化宿主菌TOP10F’。氨苄青霉素筛选出阳性转化菌并扩大培养，小量提取质粒，对所构建的重组质粒予酶切、PCR和测序鉴定。结果显示A型MBL基因全长以正向连入载体pcDNA3.1（-），成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1（-）-MBL。 （2）pCI-MBL的构建：先用MluⅠ和SmaⅠ完全酶切质粒pXL-MBL，再加入XhoⅠ进行不完全酶切，产生的酶切片段有1429 bp、1952 bp、2734 bp、3718 bp、4686 bp、6552 bp、8404 bp等七个长度差异较大的DNA片段，其中6552 bp条带DNA即为含MluⅠ和XhoⅠ酶切粘性末端的MBL全长基因片段，经凝胶电泳切出目的条带，所回收的DNA片段与用MluⅠ和XhoⅠ双酶切pCI-neo所获取的载体片段进行连接反应，同样转化宿主菌TOP10F’。氨苄青霉素筛选出阳性转化子，对所构建的重组质粒予酶切、PCR和测序鉴定。结果显示A型MBL基因全长以正向连入载体pCI-neo，成功构建了重组表达质粒pCI-MBL。 3.pcDNA3.1（-）-MBL在CHO细胞中的表达; 线性化质粒pcDNA3.1（-）-MBL后电穿孔转染CHO细胞，先后用含G418800μg/mL和400μg/mL的完全培养基依次筛选培养9d和12 d。筛选出的稳定转染细胞集落进行扩大培养，行RT-PCR鉴定的同时进行克隆化培养，采用前述ELISA体系进行检测，每孔设3复孔，检测结果应用SPSS13.0软件按one-way ANOVA法和Dunett法多重比较分析各克隆孔与两倍于阴性对照组检测值之间的差别，高于两倍阴性对照值者认为阳性表达孔。结果显示阳性孔分别是E10（P=0.001）、F10（P=0.001）、D8（P<0.001）。选D8进行扩大培养，收集培养上清，上清经mannan-Sepharose4B亲和层析柱纯化蛋白后行Western-blot鉴定，初步确定有高聚体重组MBL表达，但表达产量不高。这可能是由于整合的MBL基因不稳定，细胞增殖时出现基因丢失，与阳性表达株竞争性生长，造成重组蛋白表达量不高，另外也可能是重组蛋白纯化方法欠妥。这些，都有待进一步克隆化培养，筛选出稳定的高表达细胞株，同时优化细胞培养及蛋白纯化方法，并进一步研究其生物学特性与功能。