[目的]1、研究ITP患儿外周血T淋巴细胞PKC的活性变化，探讨T淋巴细胞PKC活性异常在ITP发病机制中的作用。 2、研究ITP患儿外周血T淋巴细胞凋亡信号蛋白FADD、Fas、FasL和NF-κB的表达，探讨凋亡信号蛋白表达异常在ITP发病机制中的作用。 3、研究PKC信号转导对ITP患儿T细胞活化增殖的影响，探讨PKC信号转导通路在ITP患儿T细胞活化增殖中的调控作用。 4、研究PKC信号转导对ITP患儿T细胞凋亡率及Fas、FasL蛋白表达的影响，探讨PKC信号转导通路在ITP患儿T细胞凋亡中的调控作用。 5、研究PKC信号转导对ITP患儿T细胞抗凋亡基因bcl-xlmRNA及其蛋白表达的影响，探讨PKC信号转导通路在ITP患儿T细胞抗凋亡中的调控作用。 [方法]1、外周血T淋巴细胞的分离取ITP患儿及正常对照组静脉血，肝素抗凝。淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，置玻璃培养皿中37℃孵育30min去除单核细胞，加入0.85％NH4Cl溶液溶解红细胞，经T细胞分离富聚柱(hCD3+TCellEnrichmentColumn)获得纯化的T细胞。加入0.2ml20％小牛血清Hanks液重悬T细胞，调整T细胞浓度至2×106/ml。FITC标记的抗CD3单克隆抗体检测其纯度，台盼蓝拒染法检测其活性。 2、T淋巴细胞分组培养以20％小牛血清RPMI1640培养液调整T细胞浓度至1×106/ml，接种于24孔培养板中，每份标本接种6孔，编为3组，每组2孔。第一组为空白对照组、第二组加入PKC激动剂佛波酯PMA(终浓度为20nM)、第三组同时加入PKC激动剂PMA和抑制剂H-7(终浓度为5uM)，每组2孔分别于5％CO2，37℃培养1、24小时。 3、T淋巴细胞PKC活性的检测利用PepTag(R)非同位素标记法检测PKC的活性，T细胞分离后，每份标本取1×106个细胞加入50ul细胞裂解液进行超声波破碎，超速离心提取蛋白，然后按试剂说明书进行磷酸化反应30分钟，再上样电泳20分钟左右，电泳后磷酸化与非磷酸化的底物肽C1被分开，磷酸化的底物带负电向正极移动，非磷酸化的底物带正电向负极移动，根据电泳后的条带进行定性与定量分析。按试剂说明书规定：PKC的活性单位定义为每分钟每毫升蛋白溶液中使底物肽C1磷酸化的纳摩尔数(nmol/min.ml)(具体的定性与定量计算按试剂说明书进行)。 4、T淋巴细胞FADD、Fas、FasL、NF-κB和Ⅰ-κB的检测用免疫组化法检测T淋巴细胞FADD与NF-κBP65蛋白的表达；以Fas-FITC、FasL-FITC作单色流式细胞术，检测T淋巴细胞Fas、FasL蛋白的表达，Westernblot检测Ⅰ-κBa蛋白的表达。 5、T淋巴细胞bcl-xl的mRNA水平和蛋白表达的检测T淋巴细胞悬液抽提总RNA，一步法特异性扩增bcl-xlmRNA，琼脂糖凝胶电泳RT-PCR的扩增产物，采用成像系统分析bcl-xlmRNA水平；T淋巴细胞悬液涂片，免疫组化法(SABC法)检测T淋巴细胞Bcl-xL蛋白的表达。 6T淋巴细胞凋亡与增殖分析6.1AnnexinV/PI双色流式细胞术检测T细胞凋亡指数。6.2梯带电泳，观察T淋巴细胞的凋亡情况。6.3CCK-8法检测T淋巴细胞的增殖能力。 [结果]1、分离纯化所得的T淋巴细胞纯度和活性均大于95％。 2、与健康儿童相比，ITP患儿外周血T淋巴细胞PKC的活性明显增强，T淋巴细胞活化标志物FasL的表达显著升高，且PKC的活性变化与FasL的表达呈正相关。 3、与健康儿童相比，ITP患儿外周血T细胞凋亡信号蛋白FADD、Fas表达下降，FasL、NF-κB的表达升高。 4、与健康儿童相比,PKC的激活剂PMA能显著促进ITP患儿外周血T细胞NF-κBP65的蛋白表达，抑制Ⅰ-κBa的表达，同时使T细胞的增殖能力增强；而PKC的抑制剂H-7的作用相反。 5、与健康儿童相比,PKC的激活剂PMA能显著抑制ITP患儿T淋巴细胞凋亡率及相关蛋白Fas、FasL表达，PKC的抑制剂H-7能明显提高T细胞的凋亡率及Fas、FasL蛋白的表达。 6、与健康儿童相比,PKC的激活剂PMA能显著提高抗凋亡基因bcl-xlmRNA及其蛋白的表达；PKC的抑制剂H-7能明显抑制抗凋亡基因bcl-xlmRNA及其蛋白的表达。 [结论]1、本研究所采用的T细胞分离纯化方法可用于科学研究。 2、ITP患儿外周血T细胞PKC的活性增强，可能导致T细胞异常活化，表明PKC信号转导可能参与ITP的免疫病理机制。 3、ITP患儿外周血T细胞凋亡信号蛋白FADD、Fas、FasL及NF-κB的异常表达可能与ITP患儿外周T细胞凋亡不足有关。 4、PKC信号转导对ITP患儿T细胞活化增殖产生影响，可能参与ITP患儿T细胞的异常活化过程，并可为ITP的临床治疗提供新靶点。 5、PKC信号转导对ITP患儿T细胞凋亡率及其凋亡相关基因的表达产生影响，T细胞凋亡异常可能与ITP的发病机制有关，并可为ITP的临床治疗提供新思路。