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[目的]
1、研究不同浓度同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡影响,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminal kinase,JNK)特异性抑制剂(SP600125)干预对Hcy诱导的HUVECs凋亡的拮抗作用.
2、探讨JNK信号途径在同型半胱氨酸诱导的HUVECs凋亡可能的作用机制.
3、观察Hcy诱导的人HUVECs单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的产生以及SP600125对它的影响.
[方法]
1、HUVECs用RPMI-1640培养基培养,将实验分八组:正常对照组(A组)、0.1mmol/L Hcy组(B组)、0.3mmol/L Hcy组(C组)、1.0mmol/L Hcy组(D组)、3.0mmol/LHcy组(E组)、10.0mmol/L Hcy组(F组)、10.0mmol/L Hey+1.0umol/1 SP600 125组(G组)和10.0mmol/L Hcy+10.0umol/1 SP600125组(H组);将G组和H组HUVECs用SP600125预处理1小时后,再用上述各种浓度的Hcy继续培养24h,分别利用TUNEL染色方法检测各组细胞的凋亡情况.
2、应用Western-blot方法检测各组细胞的JNK的表达,观察0.1mmol/L及10.0mmol/L Hcy刺激后15min、30min、1h、2h、4h及8h,JNK磷酸化水平随时间的动态变化;观察0.1、0.3、1.0、3.0、10.0mmol/L Hcy刺激后2h,JNK磷酸化水平随Hcy刺激浓度的动态变化;观察不同浓度SP600125(1.0、10.0 μM)对10.0mmol/LHcy诱导HUVECsJNK磷酸化的影响.
3、应用ELISA方法检测HUVECs在0.1、0.3、1.0、3.0、10.0mmol/L Hcy诱导下MCP-1的产生,观察SP600125(1.0、10.0 μm)对10.0mmol/L Hcy诱导HUVECs释放MCP-1的影响.
[结果]
1、TUNEL染色凋亡检测方法结果:B组对HUVECs凋亡无影响,与对照组比较无显著性差异(P>0.05),0.3mmol/L Hcy可以引起明显细胞凋亡,与对照组比较有显著性差异(P<0.01),在F组Hcy的促凋亡作用最强,细胞凋亡率达到40.21±1.30﹪.SP600125干预处理能减少细胞凋亡数目,与相应无SP600125干预组比较有显著性差异(P<0.0 1),而且SP600125干预组之间比较有显著性差异(P<0.01).
2、Western Blot检测Hcy刺激HUVECsJNK磷酸化时间动态变化:0.1mmol/L刺激时,15rain也明显磷酸化,持续至4h,并且随后JNK磷酸化水平出现下降,高峰发生在2h,3.00±0.19倍于对照组水平,差异有统计学意义(P<0.01),8h回到接近于对照组水平;10.0mmol/L刺激时,15minJNK明显磷酸化,持续至8h,高峰发生在2h～4h,6.56±0.38倍于对照组水平(P<0.01),2h与4h之间无显著性差异(P>0.05);两者均在30min出现了短暂的下降期.
3、不同浓度Hey刺激的HUVECsJNK磷酸化的结果:与Hcy存在明显的浓度依赖关系,0.1mmol/LHcy时就出现了JNK明显磷酸化,10.0mmol/L Hcy诱导下JNK最强的活化,相比于对照组,6.11±0.6l倍的升高(P<0.01).
4、不同浓度SP600125抑制Hcy诱导的JNK的磷酸化:SP600125以浓度依赖性的方式抑制Hcy诱导HUVECs中JNK的磷酸化(P<0.01).
5、细胞上清中MCP-1的含量:MCP-1的释放水平与Hcy存在明显的浓度依赖关系,10.0mmol/L Hcy诱导下MCP-1水平最高(相比对照组,P<0.01),SP600125干预处理能减少细胞MCP-1的释放,与相应无SP600125干预组比较有显著性差异(P<0.01),而且SP600125干预组之间比较有显著性差异(P<0.01).
[结论]
1、Hcy对离体培养的HUVECs增殖具有抑制作用,浓度为0.3mmol/L时即能促进细胞早期凋亡,该作用随着Hcy浓度的增加而增强,浓度为10.0mmol/L时最显著;SP600125能拮抗Hcy诱导的HUVECs凋亡作用.
2、Hcy能增强HUVECs的JNK的表达,Hey与JNK的表达呈时间依赖和剂量依赖关系,而且浓度越高持续时间越久.SP600125则能抑制Hcy诱导的JNK表达.
3、Hey可能通过上调JNK促进HUVECs凋亡,SP600125通过抑制HUVECs的JNK表达发挥其拮抗Hcy的细胞毒性作用.
4、Hcy可能促进HUVECs的MCP-产生,SP600125可能部分抑制Hcy诱导的MCP-1的产生,Hcy可能与细胞MCP-1的产生呈剂量依赖关系.