水疱性口炎(Vesicular stomatitis, VS)是由水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV）引起的多种哺乳动物的一种急性、高度接触性传染病。VSV为弹状病毒科、水疱病毒属的成员，病毒粒子为子弹状或圆柱状，病毒有囊膜，囊膜上均匀密布有长约10nm纤突。病毒内部为紧密盘旋的螺旋对称的核衣壳，VSV基因组为不分节段的线性单股负链RNA（-ssRNA），长约11kb。从3’→5’端依次排列着N、NS（P）、M、G、L等 5个不重叠的基因，分别编码核（N）蛋白、磷酸（P）蛋白、基质（M）蛋白、糖（G）蛋白、及RNA聚合酶(L)蛋白等5种不同的主要蛋白。其中核蛋白（N）和糖蛋白（G）在病毒免疫和诊断上具有重要的意义。N基因编码的病毒核蛋白（N蛋白），由422个氨基酸残基组成，分子量为47kDa。每个病毒粒子含有1258个拷贝。它可有效的保护病毒RNA免受各种核酸酶的消化。N基因编码的N蛋白呈群特异性，为许多型和亚型所共有，有高的抗原性，刺激机体产生非中和抗体，且在转录复制中担任了重要的角色。进入体内的VSV的N蛋白作为优势抗原被VSV特异性CTL细胞识别，发挥CTL作用，参与免疫反应。N蛋白是病毒衣壳蛋白，优先和前导RNA结合，形成核蛋白RNA复合体。许多免疫学方法检测抗N蛋白的抗体可以区分VSV感染和疫苗免疫。水疱性口炎被世界动物卫生组织（OIE）列为A类传染病，在我国进出境动检对象中被列为二类疫病。我国目前尚无该病的流行，随着我国加入WTO，动物及动物产品的国际贸易增加，为防止国外疫情传入我国，保护我国畜牧业的健康发展，很有必要开展对本病的研究。本研究从国外引进VSV，进行了以下研究：1． 根据文献报道的VSV N基因序列，设计特异性引物，从国外引进VSV-IND RNA，通过反转录和PCR扩增，得到编码VSV N蛋白全长的cDNA，构建了VSV N基因的重组pGEM-T-N质粒，N基因成功的克隆到pGEM-T Easy载体中。序列测定证明，重组质粒包含完整的N基因，序列全长1334bp。序列分析证明，VSV N基因高度保守。2．根据序列测定分析，重新设计特异性引物，在引物中分别加入EcoRⅠ、 XhoⅠ酶切位点。RT-PCR扩增后得到目的基因。将其克隆到表达载体pET30c，成功的构建了VSV N蛋白的表达载体，对表达蛋白分析证明所表达的融合蛋白分子量为53kDa，其中约6kDa为融合蛋白，47kDa为目的蛋白，与预测的目的蛋白大小一致。Western blot检测表明其能与本病毒阳性血清发生特异性反应，表达蛋白有望成为有价值的VSV诊断抗原。蛋白质分析发现，VSV N基因编码的核蛋白是由422个氨基酸组成的多肽，具有较强的亲水性，同VSV野生型病毒株的核蛋白同源性比较，其氨基酸序列的同源性高达98.8%以上，证明VSV核蛋白具有很好的保守性，为临床上建立VSV诊断方法奠定<WP=6>了基础。3．建立了用超声波和溶菌酶裂解菌体，用盐酸胍溶解，Ｎi++亲合层析柱纯化及体外复性等方法，经检测证明纯化的VSV 重组核蛋白抗原具有较高的活性。用表达产物作为抗原进行间接ELISA实验，检测该病毒抗血清以及其它相似病毒抗血清，结果表明，表达产物均能与该病毒的所有血清型抗血清发生良好反应，而与其它相似病毒抗血清不能发生反应，说明表达产物为该病毒的特异性核蛋白。因此，本试验生产的重组核蛋白抗原可以代替完整病毒作为ELISA检测用的标准抗原，这为建立非感染性ELISA快速检测大规模的血清样品以诊断和监测该病，并为鉴别病毒感染产生的抗体和重组G蛋白疫苗产生的抗体打下了基础。4．从VSV-IND保守的N基因中选择约620个碱基的一段序列，设计特异性检测引物，建立检测VSV的RT-PCR技术，用以检测VSV-IND和VSV-NJ病毒核酸。该方法经反复实验，能同时检测出VSV-IND和VSV-NJ病毒型，具有很好的重复性，并能用于与口蹄疫、猪水疱病、牛传染性鼻气管炎等疾病的鉴别诊断，证明了该方法具有快速、准确、特异、敏感等优点，全部实验可在1d内完成。同时，使用RT-PCR只涉及引物使用与保存，不涉及VSV的使用，可以避免散毒的危险。因此，RT-PCR方法特别适合没有VSV的国家和地区的口岸检疫。