柑橘是世界第一大果树,无核是其作为鲜食水果的优良经济性状之一,而雄性不育是导致果实无核的重要原因。因此,雄性不育机理研究是柑橘品种无核化改良的重要前提。雄性不育胞质杂种‘华柚2号’（G1+HBP）是以胞质雄性不育品种‘国庆1号’温州蜜柑（G1）和可育品种HB柚（HBP）为亲本经原生质体融合创制,遗传上相当于其可育亲本HBP的雄性不育突变体,是研究柑橘雄性不育的理想材料。本研究以‘华柚2号’和HB柚为研究对象,在前人基础上,利用细胞学、转录组、代谢组及生理测定等方法解析‘华柚2号’雄性不育的生理特征,为进一步揭示其不育机理奠定基础。miRNAs是调控植物生殖发育的重要调节因子,在前期解析‘华柚2号’雄性不育分子机制研究中,通过小RNA测序（s RNA-seq）发现CsmiR399a.1下调可能与‘华柚2号’雄性不育有关。本研究在柑橘本物种模式材料短童期山金柑中验证CsmiR399a.1功能,并深入解析其调控柑橘花器官发育和雄性不育的机制。主要研究结果如下:1.胞质杂种‘华柚2号’雄性不育表型、基因表达及生理特征‘华柚2号’花药发育缺陷、开裂受阻,花粉不育:与HB柚比较,‘华柚2号’花瓣变小畸形,不能完全包被雄蕊与雌蕊;雄蕊发育异常—雄蕊原基分化受到抑制,花药室分化受阻,花药畸形、数目减少,成熟花药开裂受到抑制;绒毡层异常增厚且降解异常,中层降解异常,花药内壁异常加厚且在花药发育后期不能正常形成纤维素带和进行次生木质化加厚;相邻药室之间隔膜区不能正常进入PCD降解。此外,‘华柚2号’花粉母细胞减少,减数分裂异常,花粉减少,花粉壁形成受阻,花粉不育。‘华柚2号’雄性不育的基因表达特征:为探索‘华柚2号’花药发育异常与花粉不育原因,对发育至减数分裂至小孢子初生外壁形成的花药进行转录组测序分析,发现在‘华柚2号’上调表达的基因显著富集到细胞活动（染色体行为、DNA行为、有丝分裂、减数分裂及细胞程序性死亡等）、花器官及小孢子发育、茉莉酸（JA）信号及类黄酮代谢GO类别;在‘华柚2号’下调表达的基因显著富集到初生代谢路径GO类别,包括碳水化合物、氨基酸、有机酸及脂肪酸等。‘华柚2号’雄性不育的代谢及生理特征:对‘华柚2号’及HB柚叶、花及花器官各组织的初生及次生代谢物进行测定,发现初生及类黄酮代谢在两个材料花药中差异最显著。与HB柚比较,‘华柚2号’花药多数氨基酸和脂肪酸显著下调,多数有机酸显著上调,糖下调,醇上调;两个材料类黄酮代谢差异也在花药最显著,检测到的43种类黄酮中有39种的积累水平在两个材料花药之间有显著差异。用TUNEL对花药PCD进行检测,与HBP比较,‘华柚2号’花药壁提前进入而绒毡层延迟进入PCD过程。ROS含量检测发现,‘华柚2号’花器官H?O?含量显著下调;ROS清除酶活性检测,发现POD、SOD及CAT三种ROS清除酶活性在‘华柚2号’花发育各时期均显著高于HB柚。此外,ATP含量测定发现ATP含量在两材料花器官发育早期、后期及成熟叶器官之间无显著差异,在花粉母细胞时期花器官‘华柚2号’显著高于HB柚。2.CsmiR399a.1-CsUBC24调控柑橘花器官发育和雄性不育的功能CsmiR399a.1功能验证及表型鉴定:在柑橘模式材料山金柑超量表达CsmiR399a.1短串联靶标模拟（CsmiR399a.1-STTM）下调CsmiR399a.1,导致花器官发育异常、成熟花药开裂受到抑制及花粉育性下降。CsmiR399a.1-STTM转基因系花器官从发育早期就异常,异常表型主要体现在花瓣和雄蕊,包括花瓣减少变小不能完全包被花药和柱头,花丝排列异常且减少变短,花药减少。利用SEM观察花药表面气孔及花粉形态,发现CsmiR399a.1-STTM转基因系花药远轴面气孔打开受到抑制,花粉坍塌;进一步利用TEM观察花粉内部结构及利用I2-KI对成熟花粉进行染色观察,发现CsmiR399a.1-STTM转基因系花粉在发育前期淀粉积累不足、后期降解不彻底。在Pi充足环境下生长时,CsmiR399a.1-STTM转基因系叶器官总磷含量下调,表现出地上部及主根生长受抑制、侧根变密的典型缺磷症状;CsmiR399a.1-STTM转基因系淀粉代谢及Pi平衡相关基因表达受到显著影响。综上可知,CsmiR399a.1下调可模仿Pi缺乏环境,扰乱淀粉代谢,进而导致花粉塌陷,育性下降。CsmiR399a.1调控花发育和雄性不育的作用机制解析:利用RLM-5′RACE与烟草瞬时共表达分析确定了与拟南芥At UBC24（PHO2）同源的CsUBC24为CsmiR399a.1的靶基因,用酵母双杂交技术及断裂荧光素互补实验发现并证明CsUBC24与花发育调空因子SEPALLATA家族（Cs SEP1.1、Cs SEP1.2和Cs SEP3）及花药开裂调节因子CBF EXPRESSION 1（Cs ICE1）互作。与野生型相比,CsmiR399a.1-STTM转基因系Cs ICE1表达量显著上调,Cs SEP3下游花分生组织确定基因Cs LMI2表达量显著下调。推测CsUBC24通过下调Cs SEPs蛋白表达破坏花分生组织调控网络并导致花发育异常;通过与Cs ICE1互作,破坏花药表面气孔功能,从而抑制花药开裂。综上所述,本研究基于细胞学、转录组、代谢组及生理测定等方法剖析了‘华柚2号’雄性不育的生理特征;验证了CsmiR399a.1调控柑橘生殖发育的功能,并解析了CsmiR399a.1-CsUBC24调控柑橘花器官发育和雄性不育的分子机制。