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猪繁殖障碍性疫病是近年来养猪生产实践中最为普遍和突出的问题,已给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。其中猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、圆环病毒和伪狂犬病毒等在临床上多引起猪的繁殖障碍性疫病,且常呈混合或继发感染。本研究采集临床疑似猪繁殖障碍性疫病病料,在初步分析和鉴别诊断的基础上,对繁殖障碍性疫病流行病毒株的分离和鉴定,克隆并分析其重要功能基因,为研制新型疫苗奠定基础;并建立适于临床应用的快速诊断方法,为猪病防控提供有效的技术手段。主要研究如下:1、采集江西省某猪场疑似猪繁殖障碍性疫病病料,经RT-PCR检测为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)阳性,病料处理后接种Marc-145细胞盲传,传至第6代时出现明显的细胞病变,RT-PCR检测为阳性,继续传代增殖,扩增、克隆和分析其基因代表序列,测定病毒感染细胞和靶动物的能力,电镜观察病毒粒子形态。结果测定PRRSV的感染滴度为108.02/mL TCID50;感染实验仔猪可复制到猪蓝耳病典型的临床症状和病理变化;电镜观察可见约20nm的典型的PRRS病毒粒子,表明已成功地分离到一株美洲型PRRSV流行株(命名为JX0708株)。随后利用RT-PCR分段扩增法,从分离株中分别扩增PRRSV Nsp2非结构蛋白、ORF2～ORF7结构蛋白全基因,其中Nsp2非结构蛋白长3496bp,结构蛋白全基因长3176bp。NSP2非结构蛋白氨基酸序列分析发现,该毒株与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株的同源性高达99.4%(JX143株,EU708726),与美洲型代表株VR-2332相比缺失了30个氨基酸,这表明该毒株为变异的美洲型PRRSV毒株。结构蛋白基因遗传演化关系分析进一步证实该毒株的变异存在某种地域上的相关性,但每个基因的变异,并不严格遵从地域上的相关性。2、采集甘肃兰州某猪场疑似猪瘟病料,处理后接种PK-15细胞盲传,经RT-PCR检测为猪瘟病毒(CFSV)E2基因阳性,继续传代增殖,测定病毒感染细胞和动物的能力,电镜观察病毒粒子形态。电镜观察可见约25nm的典型的CSF病毒粒子。细胞毒接种于家兔无体温变化,接种30日龄仔猪可复制到猪瘟典型的临床症状和病理变化,证实已分离到猪瘟强野毒株CSFV GSLZ株。已CSFV GSLZ株分离毒为材料,采用RT-PCR技术扩增到了其E2全基因,长度为1111bp,与标准参考毒株及其国内外分离株同源性比较,发现与其有较高的同源性。与中国C株的氨基酸序列及其抗原表位比较,发现在主要抗原区发生了变异。3、利用PCR技术从断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)疑似病料中,扩增、克隆和分析了两株PCV2全基因组,全长均为1767bp,同源性和结构特性分析显示两种毒株的变异主要发生在ORF2区段,ORF1区段相对较保守。遗传演化关系分析显示,本试验克隆的2株PCV2皆属于欧洲型毒株,2株病毒全基因组序列同源性为95.8%,分别命名为PCV2 GSLZ(登录号为FJ447482)和GSBY毒株,这对PCV2的分子流行病学调查以及预防控制提供了理论依据。4、本研究在建立CSFV、PCV2、PRRSV和PRV单项PCR诊断方法的基础上,成功建立了同时检测CSFV、PCV2、PRRSV和PRV的多重PCR诊断方法,并对30份临床样品检测,证明该方法具有很好的特异性、敏感性和重复性,这为上述几种繁殖障碍性疫病的早期诊断和鉴别诊断提供了一种快速、敏感、特异的诊断方法,也为其病原的分离、分子流行病学调查以及免疫预防控制提供了理论依据。