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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)系圆环病毒科、圆环病毒属成员之一,属于无囊膜单股环状负链DNA病毒,基因组大小约为1.8kb。由PCV2引起的各种疾病分布广泛。鉴于目前临床上很难有单一PCV2感染发病病例,猪圆环病毒2型常与猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)或猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)形成两重或多重感染,并且PCV2与上述病毒均存在共同细胞嗜性,均能在猪肾细胞系(Porcine kidney cell line,PK15)中增殖,从而导致应用传统方法极难从病料样品中通过细胞传代方式分离获得单纯的PCV2病毒。然而,PCV2反向遗传操作技术在该病毒的分离上具有独特的优势,利用该技术可以从病料样品中快速扩增获取PCV2全基因组,通过构建其感染性克隆,可实现病毒的拯救,从而实现从病料样品中获得单纯的PCV2毒株,即完成病毒的分离。本论文拟利用实验室建立的PCV2反向遗传操作平台,对六株不同来源病料样品中的PCV2野毒进行分离,比较分析不同来源PCV2毒株的分子遗传特征。该研究一方面可以丰富贵州省PCV2分子流行病学调查资料,为PCV2的分离获得提供新的策略;另一方面可为贵州省PCV2病毒库建设,从中筛选免疫原性优良的毒株提供技术参考,对深入开展PCV2的疫苗免疫防控研究具有重要意义。1、6株贵州省猪圆环病毒2型的分离与初步鉴定应用实验室已建立的反向遗传操作平台,分别对临床送检的不同病症PCV2阳性样品,如流产胎儿、典型皮炎肾炎综合症发病猪血液样品、多重感染的普通组织病料样品和PCV2抗体检测阳性的送检血清样品等,PCR扩增其PCV2全基因组,经与pcDNA3.1(+)真核表达载体定向连接后,分别构建了ZYMT2015、ASXX2015、MJBM2015、GYYY2015、CSGS2012以及GYXW2014样品的pcDNA3.1(+)-PCV2感染性克隆质粒。分别将构建的上述感染性克隆质粒,腹腔注射昆明小鼠进行体内病毒拯救后,取小鼠过滤血清接种至PK15细胞,连续传代3次后,检测并初步鉴定分离毒株。免疫过氧化物酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)鉴定结果表明,在连续传代3次后的PK15细胞中,可见感染细胞呈橘红色特异性着色;用特异性的检测用引物,对细胞培养液进行PCV2全基因组的PCR检测鉴定,其结果表明均能扩增出与预期相符的特异性DNA片段。初步鉴定结果表明,应用已建立的反向遗传操作平台,成功地从不同病症的多重病毒感染样品中,分离获得了6株PCV2毒株,即PCV2 ZYMT2015株,基因组大小为1767bp;PCV2 ASXX2014株,基因组大小为1767bp;PCV2 MJBM2015株,基因组大小为1766bp;PCV2 GYYY2015株,基因组大小为1768bp;PCV2 CSGS2012株,基因组大小为1766bp;PCV2GYXW2014株,基因组大小为1767bp。2、6株猪圆环病毒2型贵州分离株遗传变异分析为了解分离毒株的遗传变异特点,应用生物信息学相关软件对上述6株不同病症来源的PCV2毒株,31株国内外PCV2参考株,尤其是现有疫苗毒株(LG株、SH株)的基因组序列进行比较了分析。全基因组核苷酸序列分析结果表明,与先前报道的含有11个ORF的PMWS对照毒株(AF027217)相比,其遗传变异主要表现在ASXX2014、GYYY2015均含有10个ORF(分别缺失ORF9和ORF4),ZYMT2015、GYXW2014均只含有9个ORF(分别均缺失ORF8和ORF11);CSGS2012株主要变异表现为ORF1的提前终止和ORF3的起始密码子前置;MJBM2015主要变异表现为ORF1起始密码子的后移动。基因分型结果表明MJBM2015、ASXX2015株为PCV2b基因型,CSGS2012株、GYYY2015株为PCV2a基因型,ZYMT2015、GYXW2014株为PCV2d基因型。推导主要结构蛋白的预测结果表明,ORF1、ORF2、ORF3编码蛋白均为混合型蛋白;除CSGS2012、BJMJ2015的ORF1编码蛋白的潜在磷酸化位点与参考毒株差异较大外,剩余毒株之间除丝氨酸磷酸化位点差异较大外,苏氨酸、酪氨酸磷酸化位点完全相同;各毒株之间ORF2编码蛋白的潜在磷酸化位点均存在一定程度的变异;各毒株Cap蛋白的三级结构预测结果表明,其和SWISS数据库中的3jcj.1、疫苗毒株结构的相似性均在90%以上。