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第一部分MicroRNA-146b-3p通过调控FAM107A促进结直肠癌的进展和转移目的:通过高通量数据筛选出结直肠癌肿瘤患者差异表达的miR-146b-3p并用细胞和组织进行了验证,分析miR-146b-3p的表达失调对增殖、侵袭和迁移的影响,探讨miR-146b-3p可能作用的下游靶基因FAM107A,并加以验证明确调控机制。为结直肠癌的治疗提供新的思路。方法:使用生物信息学软件进行初筛验证,用Array Express（E-MTAB-4036）和GEO（GSE53159）数据库对miRNA进行重叠分析;体外培养结直肠组织和结直肠癌细胞系（NCM460、DLD1、SW48、SW620和Lo Vo）,采用实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测相应miRNA在结直肠癌组织和细胞系中的表达水平;收集结直肠癌肿瘤组织标本（病灶组织和对应的癌旁正常组织）和相应患者的临床信息,分析miR-146b-3p表达与结直肠癌患者年龄、性别、是否淋巴结转移以及TNM分期等因素之间的关系;采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）细胞增殖实验和跨孔迁移侵袭实验,分析miR-146b-3p对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响;采用流式细胞术研究miR-146b-3p对结直肠癌细胞周期和凋亡的影响;选用雄性BALB/c裸鼠建立动物实验模型,检测肿瘤生长情况,分析miR-146b-3p表达水平产生的影响;使用GSE50117和GSE156355对DEGs进行重叠分析,并通过miRWalk数据库预测靶点和确定候选靶基因;体外培养结直肠组织和结直肠癌细胞系（NCM460、DLD1和SW48）,采用实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测相应靶点基因在结直肠癌组织和细胞系中的表达水平;在收集的结直肠癌肿瘤组织标本中,分析FAM107A表达与结直肠癌患者年龄、性别、是否淋巴结转移以及TNM分期等因素之间的关系;通过western blotting研究miR-146b-3p和FAM107A表达对cyclin D1表达的影响;用荧光素酶实验来验证miR-146b-3p是否直接靶向FAM107A的3′UTR;采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）细胞增殖实验和跨孔迁移侵袭实验及流式细胞术研究等,分析miR-146b-3p/FAM107A轴表达对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡的影响。结果:采用生物信息学软件进行初步初筛,用Array Express（E-MTAB-4036）和GEO（GSE53159）数据集筛选出DEMs并对DEMs进行重叠分析:我们在结直肠癌组织和非肿瘤组织中发现了13个DEMs初筛目标。采用实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）评估miR-146b-3p、miR-1183和miR-940在结直肠癌组织和结直肠癌细胞系（NCM460、DLD1、SW48、SW620和Lo Vo）中的相对表达发现:在miRNAs中,miR-146b-3p在四种结直肠癌细胞系中的过表达高于NCM460细胞（图1D）;我们还发现miR-146b-3p在DLD1和SW48细胞中的表达水平明显高于SW620和Lo Vo细胞;因此,选择DLD1和SW48细胞进行后续分析。收集结直肠癌肿瘤组织标本,分析miR-146b-3p的表达情况发现:根据是否有淋巴转移分类,有淋巴结转移的患者miR-146b-3p表达阳性的占70.4%,无淋巴结转移的患者miR-146b-3p表达阳性的占20.0%;根据结直肠癌TNM分期分类,Ⅰ期患者miR-146b-3p表达阳性的占9.1%,Ⅱ期患者表达阳性的为56.3%,Ⅲ期患者表达阳性的为80.0%;且miR-146b-3p在结直肠癌组织中的表达高于NC组织（P<0.05）。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）细胞增殖实验和跨孔迁移侵袭实验及流式细胞术,分析miR-146b-3p对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响:miR-146b-3p过表达促进DLD1和SW48细胞的增殖、侵袭和迁移,而miR-146b-3p的下调明显抑制CRC细胞的增殖、侵袭和迁移;miR-146b-3p过表达明显促进结直肠癌细胞周期和减弱结直肠癌细胞凋亡,而下调miR-146b-3p则有相反的效果。建立动物实验模型,检测肿瘤生长情况,分析miR-146b-3p表达水平产生的影响:发现miR-146b-3p的上调对体内动物实验的结直肠癌发生发展有促进作用。接下来探讨miR-146b-3p促进结直肠癌的可能机制,使用GSE50117和GSE156355对DEGs进行重叠分析,并通过miRWalk数据库预测靶点。采用实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测相应靶点基因在结直肠癌组织和细胞系（NCM460、DLD1和SW48）中的表达水平:我们发现3个基因在结直肠癌组织中的表达水平低于正常组织,且DLD1和SW48细胞中FAM107A的表达与NCM460细胞相比最显著下调;此外结直肠癌组织标本检测根据是否有淋巴转移分类,有淋巴结转移的患者FAM107A表达阳性的占33.3%,无淋巴结转移的患者FAM107A表达阳性的占73.3%;根据结直肠癌TNM分期分类,Ⅰ期患者FAM107A表达阳性的占81.8%,Ⅱ期患者表达阳性的为50.0%,Ⅲ期患者表达阳性的为20.0%;且FAM107A在结直肠癌组织中的表达低于NC组织（P<0.05）用荧光素酶实验来验证miR-146b-3p是否直接靶向FAM107A的3′UTR:结果表明,在DLD1和SW48细胞系中,FAM107A-WT-3′-UTR质粒的荧光素酶活性随着miR-146b-3p表达的上调而明显降低,在miR-146b-3p表达下调时显著增加。然而,FAM107A-MUT-3′-UTR质粒的荧光素酶强度没有改变。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）细胞增殖实验和跨孔迁移侵袭实验及流式细胞术研究等,分析miR-146b-3p/FAM107A轴表达:我们发现FAM107A的上调可以显著逆转miR-146b-3p的过度表达对DLD1和SW48细胞的增殖、侵袭和迁移的促进作用,也同样逆转了miR-146b-3p的过度表达促进结直肠癌细胞周期和减弱结直肠癌细胞凋亡的作用（P<0.05）。通过western blotting实验分析miR-146b-3p表达上调对cyclin D1表达的影响。我们观察到miR-146b-3p的过度表达显著增加了cyclin D1的表达,而且这可以被FAM107A的过度表达逆转。同时,miR-146b-3p对细胞周期蛋白A的表达没有影响。结论:miR-146b-3p在结直肠癌中是一个癌基因。它以FAM107A为靶点,调控细胞增殖、细胞周期进程和凋亡。第二部分转录因子SP1诱导microRNA-146b-3p调控FAM107A促进结直肠癌的进展和转移目的:研究结直肠癌MiR-146b-3p/FAM107A轴的上游调控因子及调控机制。方法:为了研究miR-146b-3p表达的上游调控,使用JASPAR数据库预测可以调控miR-146b-3p启动子的TFs。体外培养结直肠癌细胞组织和细胞系（NCM460、DLD1、SW48）,q RT-PCR检测所预测TFs的表达水平。采用westernblot法检测SP1对两株结直肠癌细胞FAM107A、cyclin D1和cyclin A表达的影响。采用q RT-PCR检测SP1上调对MiR-146b-3p/FAM107A轴的影响。采用Transwell法检测SP1上调后对结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力的影响。进行芯片分析以探讨SP1是否转录调控miR-146b-3p的表达。利用JASPAR数据库预测miR-146b-3p启动子区SP1的结合位点,用荧光素酶实验来验证。结果:分析miR-146b-3p表达的上游调控,使用JASPAR数据库预测可以调控miR-146b-3p启动子的TFs。体外培养结直肠癌细胞组织和细胞系（NCM460、DLD1、SW48）,q RT-PCR检测可能调控miR-146b-3p表达的前五位潜在TFs（SP1、ZSCAN4、ZNF263、RBPJ和EGR3）的表达水平:我们发现与NCM460细胞相比,DLD1和SW48细胞中SP1的表达水平显著上调。采用western blot法检测SP1对两株结直肠癌细胞FAM107A、cyclin D1和cyclin A表达的影响:分析结果显示,在两种结直肠癌细胞系中,SP1上调显著提高了细胞周期蛋白D1的表达,降低了FAM107A的表达。相反,SP1对cyclin A的表达没有影响。采用q RT-PCR检测SP1上调对MiR-146b-3p/FAM107A轴的影响。采用Transwell法检测SP1上调后对结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力的影响。我们发现SP1上调明显增强了miR-146b-3p的表达水平。这些结果还表明,高SP1表达增强了CRC细胞的增殖、侵袭和迁移能力,而miR-146b-3p抑制剂可显著逆转这些作用（P<0.05）进行染色质免疫共沉淀技术实验以探讨SP1是否转录调控miR-146b-3p的表达。利用JASPAR数据库预测miR-146b-3p启动子区SP1的结合位点:我们发现,前miR-146b-3p启动子区域上游1091-1100 bp处的区域被SP1靶向。采用荧光素酶实验分析:结果显示野生型WT miR-146b-3p启动子中的荧光素酶活性在SP1过度表达时显著上调,而miR-146b-3p的敲除缺显著降低了该活性。有趣的是,当1091-1100 bp的SP1结合位点发生突变时,荧光素酶活性没有显著差异。这些结果表明SP1在转录水平上直接调控miR-146b-3p。结论:转录因子SP1诱导的miR-146b-3p通过靶向FAM107A来调控促进结直肠癌的进展和转移。