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目的:间变性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶抑制剂(anaplastic lymphoma kinase tyrosine kinase inhibitor,ALK-TKI)的耐药已成为其临床应用最普遍也是最大的障碍,旁路信号通路的激活是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)靶向治疗的耐药机制之一。本研究旨在探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)及转化生长因子-α(transforming growth factor-α,TGF-α)以旁路信号激活的方式诱导棘皮动物微管结合蛋白样蛋白4-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因阳性肺癌细胞株H3122对alectinib的耐药,并进一步探讨旁路信号激活在alectinib耐药中的作用。方法:1.ALK阳性肺癌细胞H3122对alectinib的敏感性检测检测ALK阳性肺癌细胞H3122对alectinib的敏感性,H3122细胞含EML4-ALK融合基因变体1。根据CCK-8使用说明书,检测H3122细胞在不同浓度的alectinib处理下,细胞的增殖情况。HGF、EGF、TGF-α诱导后ALK阳性肺癌细胞H3122对alectinib的敏感性的检测,应用HGF(50ng/m L)、EGF(100 ng/m L)、TGF-α(100 ng/m L)联合不同浓度的alectinib处理H3122细胞,继续培养72h后,检测在有HGF、EGF、TGF-α存在的情况下ALK阳性肺癌细胞H3122细胞对alectinib敏感性变化。2.采用流式细胞术检测H3122细胞在0.05μmol/L alectinib作用48h的凋亡率,检测HGF(50 ng/m L)、EGF(100 ng/m L)、TGF-α(100 ng/m L)诱导后alectinib对H3122细胞的凋亡率。3.应用免疫印迹(Western blot)技术检测alectinib单独或联合HGF(50ng/m L)、EGF(100 ng/m L)、TGF-α(100 ng/m L)处理后H3122细胞中ALK、MET、EGFR及磷酸化蛋白的表达,并观察其下游信号通路关键蛋白AKT、ERK、p-AKT、p-ERK水平,探讨分子机制。结果:1.ALK阳性肺癌细胞H3122对alectinib高度敏感Alectinib作用72h后,H3122的活性随着alectinib药物浓度的增加而逐渐下降,呈浓度依赖性,alectinib对H3122的IC50为0.042μmol/L。2.在外源性HGF、EGF、TGF-α的暴露下,H3122细胞对alectinib的敏感性显著下降,HGF、EGF、TGF-α诱导后alectinib抑制H3122细胞的生长曲线往右移,HGF、EGF、TGF-α处理能够缓解alectinib对H3122细胞活性的抑制作用。3.Alectinib对H3122细胞有促凋亡作用(P<0.05),0.05μmol/L的alectinib作用H3122细胞株48h后的凋亡率为(20.12±1.36)%,而alectinib联合HGF、EGF、TGF-α后的凋亡率分别为(7.85±1.03)%、(5.6±0.79)%、(4.58±1.00)%,显著低于alectinib单药处理(P﹤0.05)。4.蛋白检测提示H3122细胞可测得ALK和下游信号通路蛋白AKT、ERK及其磷酸化蛋白,0.05μmol/L alectinib单药作用2h后成功抑制ALK及其下游信号蛋白AKT、ERK的磷酸化。联合50 ng/m L HGF、100 ng/m L EGF、100 ng/m L TGF-α后H3122细胞中的p-ALK被抑制,但仍然表达p-AKT、p-ERK,50 ng/m L HGF处理后明显增加细胞中p-MET的表达,100 ng/m L EGF、100 ng/m L TGF-α处理后明显增加细胞中p-EGFR的表达。结论:HGF、EGF、TGF-α可通过旁路激活的方式诱导EML4-ALK阳性肺癌细胞H3122对alectinib耐药,其机制可能与HGF激活MET磷酸化,EGF、TGF-α激活EGFR磷酸化有关。