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一、目的复制衰老是正常人体细胞在体外分裂潜能受限制的现象,是细胞的一种存在形式,在眼部可能与多种年龄相关性疾病有关。本研究目的是观察一定波长下不同强度的蓝光对培养人（retinal pigment epithelium,RPE）细胞中衰老相关β—半乳糖苷酶（senescence associated beta-galactosidae,SA-β-Gal）活性的作用,及不同浓度的维生素E（Vitamin E,VitE）对复制衰老细胞的作用,为进一步研究老年性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）等眼部病变与复制衰老的关系提供依据。二、方法1.人RPE细胞的体外培养以因意外死亡的新鲜人眼球为材料,采用胰蛋白酶消化法进行RPE细胞的原代培养,镜下观察细胞形态及生长状态,以免疫组织化学方法进行细胞鉴定。待细胞基本融合后,将细胞以1:2～1:3传代,用含10%FBS的DMEM培养液继续培养。以后每4～7天传代,观察细胞的生长状态,描记生长曲线。2.蓝光诱导RPE细胞复制衰老和VitE的作用取生长良好的人RPE细胞,自第2代开始在培养液中加入VitE,使不同分组培养液中VitE终浓度分别为100μmol/L、50μmol/L、10μmol/L和0;给予波长450nm～500nm,细胞表面水平光照度分别为（2000±500）lux、（1000±200）lux、（500±100）lux和0的分组光照,每天光照1小时。在此基础上各组细胞正常培养传代至第5代,并观察细胞形态及生长状态。将不同光照处理后的第5代细胞接种于24孔板,培养24小时,固定30分钟,0.1%TritonX-100室温下作用20分钟,加入SA-β-Gal检测液,室温、避光,显色24小时,高倍镜下观察细胞中是否有蓝色颗粒的表达;将各组不同光照强度处理后的细胞接种于96孔板,37℃,5%CO2培养箱内培养24小时,每孔加入DMSO150μl,微型振荡器振荡10分钟,600nm测定光密度（optical density,OD）值。3.统计学方法采用SPSS 13.0统计软件,经正态性检验和方差齐性检验,满足条件后进行双因素方差分析,用SNK法进行多重比较。P＜0.05具有统计学意义。三、结果1.人RPE细胞形态特征原代细胞24～48小时后基本能够贴壁并变得扁平,4～5天后贴壁细胞会伸出伪足,呈不规则多角形,中央的圆形透明区域为细胞核,可见到处于分裂期的双核和多核细胞以及呈集落生长的细胞团。免疫组织化学检测呈阳性反应,胞浆被染成棕黄色。5～10天原代细胞基本融合。随传代次数增加,胞浆中的黑色素颗粒逐渐减少,渐趋于透明。复制衰老人RPE细胞体积增大,胞体变平,多数细胞失去多角形态,长的细胞突起增多。经SA-β-Gal活性染色,复制衰老细胞被染成淡蓝色。2.蓝光诱导复制衰老及VitE的抑制复制衰老作用SA-β-Gal活性检测:随光照强度增加和VitE浓度降低,细胞SA-β-Gal染色阳性率升高。不同光照强度之间F=20.76（P＜0.01）,各光照强度作用效果差别均具有统计学意义（P＜0.05）;不同VitE浓度之间F=16.76（P＜0.01）,各浓度作用效果除10μmol/L组与无VitE组（P＞0.05）外差异均具有统计学意义（P＜0.05）。MTT检测:随光照强度增加和VitE浓度降低,细胞增殖能力有降低趋势。不同光照强度之间F=10.26（P＜0.01）,其中（2000±500）lux、（1000±200）lux、（500±100）lux三组OD值差异无统计学意义（P＞0.05）,无光照组OD值和这三组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）;不同VitE浓度之间F=27.27（P＜0.01）,各浓度作用效果除100μmol/L组与50μmol/L组（P＞0.05）外差异均具有统计学意义（P＜0.05）。四、结论1.应用本实验的方法可以成功完成人RPE细胞培养,以及在此基础上的细胞传代、冻存及复苏,效果满意。2.一定范围光照强度的蓝光能诱导人RPE细胞的复制衰老,随光照强度在一定范围内增强,RPE细胞SA-β-gal活性染色阳性率增加。3.VitE一定程度上抑制蓝光光照诱导的RPE细胞复制衰老,抑制效果随VitE浓度的升高而在一定范围内增强。4.初步验证了因光照引起的氧化损伤是造成RPE细胞复制衰老的机制之一,为研究AMD等年龄相关性疾病的发病机制提供依据。