论文部分内容阅读
植物的生长发育会受到生物胁迫和非生物胁迫的影响,在胁迫条件下,植物会在生理和分子水平做出应答反应,对逆境表现出不同的抗性。miRNA在植物生长发育、胁迫应答和激素信号转导等方面发挥了重要作用。本研究以锦橙、资阳香橙、飞龙枳实生苗和锦橙/资阳香橙、锦橙/飞龙枳嫁接苗为试验材料,对16个可能响应嫁接的miRNA及其靶基因,在柑橘叶片和根系中进行荧光定量PCR检测,分析嫁接前后的表达差异;对不同砧穗的嫁接苗和实生苗柑橘的韧皮部进行小RNA测序,通过生物信息学和分子生物学分析等手段,筛选差异和特异表达的miRNA,挖掘能够进行长距离转运的miRNA;同时对柑橘植株进行碱胁迫处理,测定叶片中脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）的含量,及过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的酶活性,以及miRNA和对应靶基因的表达量。通过以上研究,分析柑橘砧穗互作的分子机制,阐明miRNA参与调控的耐碱机理。主要研究结果如下:1、嫁接后4个月（2016年7月15日）,待接穗长出10片叶左右时,采集实生苗和嫁接苗的叶片和根系,提取total RNA,利用荧光定量PCR检测16个miRNA及其靶基因的表达,结果证明嫁接对柑橘miRNA的表达有直接的影响。嫁接促进了接穗中一些与调控植物生长发育、胁迫应答及激素信号转导相关的miRNA的表达,并抑制了其对应靶基因的表达;而在砧木中,嫁接对根系的影响更多的表现为抑制与植物生长发育、胁迫应答相关的miRNA的表达,促进其靶基因的表达。受影响的miRNA的种类及其表达水平的差异在不同砧木间有明显差异。2、利用高通量测序技术,对柑橘韧皮部中的miRNA进行了鉴定。从柑橘韧皮部组织获得的10个小RNA文库中共鉴定到59个已知miRNA和118个新的miRNA,这177个miRNA属于47个家族,并预测了miRNA的靶基因。3、利用测序数据对嫁接后差异或特异表达的miRNA以及可能在砧穗间转运的miRNA进行了分析鉴定。测序结果显示,接穗中,在锦橙/资阳香橙砧穗组合中,嫁接后上调表达的miRNA有8个,下调表达的有5个;在锦橙/飞龙枳砧穗组合中,嫁接后上调表达的miRNA有9个,下调表达的有14个。两种不同的砧穗组合中发现的有共同表达差异的基因有7个。砧木中,在锦橙/资阳香橙砧穗组合中,嫁接后上调表达的miRNA有5个,下调表达的有4个;在锦橙/飞龙枳砧穗组合中,嫁接后上调表达的miRNA有19个,下调表达的miRNA有3个。两种不同的砧穗组合中筛选到的共同差异基因有2个。生物信息学分析结果显示,和实生苗的锦橙相比,锦橙/资阳香橙组合中与砧木中表达水平相关的明显上调表达的miRNA有7个,在锦橙/飞龙枳组合中有8个。这些miRNA在嫁接后的接穗中表达水平显著升高的主要原因除了受嫁接诱导外,有可能存在嫁接后miRNA从砧木向接穗转移造成表达量升高。同样,和实生苗的砧木相比,在锦橙/资阳香橙砧穗组合中,与接穗中表达水平相关的在嫁接后明显上调表达的miRNA有3个,在锦橙/飞龙枳砧穗组合中有6个,这些miRNA也有可能在嫁接后从接穗向砧木做长距离转移。荧光定量PCR的验证结果显示,在以上嫁接后的砧木或接穗中,表达明显受和其嫁接在一起的接穗或砧木影响的miRNA中,只有miR395和chrUn35093有可能在柑橘的砧穗之间长距离转移。4、研究了碱胁迫（pH 9.0）对柑橘叶片脯氨酸、丙二醛、POD、SOD和CAT酶活性等生理生化特性以及对柑橘16个miRNA及其靶标基因表达的影响。生理生化指标测定结果表明:随着碱胁迫处理时间的增加,柑橘叶片脯氨酸含量先下降后上升,丙二醛含量先上升后下降,POD和SOD活性呈先上升后下降,CAT活性呈先上升后下降再上升的规律性变化。对5种试验材料通过隶属函数进行综合评价分析,结果指出,嫁接后接穗的耐碱性有明显提高。荧光定量PCR检测结果表明:与对照相比,实生苗飞龙枳、嫁接苗锦橙/飞龙枳和锦橙/资阳香橙叶片中多数miRNA在碱胁迫5d、10d和30d后下调表达,而实生苗资阳香橙和锦橙叶片中的miRNA表达上调和下调的数量差异不明显。多数靶基因的表达变化与miRNA的表达呈负相关性,有部分靶基因的表达与miRNA表达的负相关性不明显。碱胁迫下,与调控植物生长发育、胁迫应答和激素信号转导相关的miRNA及其对应靶标基因的表达发生了显著变化,这些变化和柑橘种质的耐碱性相关。本研究为阐明嫁接对miRNA表达的影响,以及miRNA参与调控柑橘的生长发育和耐/抗碱胁迫的作用机制奠定了基础,为进一步挖掘可在砧穗之间进行长距离转运的miRNA提供了参考价值。