动脉粥样硬化是一种由于血管斑块的堆积而使动脉血管堵塞的慢性疾病。在西方国家,动脉粥样硬化是大多数心血管疾病的主要表现形式和致死病因。当疾病发展至后期时,根据其所影响的动脉位置不同,动脉粥样硬化会演变为冠状动脉疾病、中风、外周动脉疾病及肾脏问题。动脉粥样硬化的主要成因为脂质、巨噬细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞及纤维组织在动脉中大量堆积,形成动脉粥样斑块从而堵塞血管。在动脉粥样硬化病程中一个明显的标志为载脂的巨噬细胞在内皮下区域的大量积累。这些载脂蛋白的细胞会促进动脉壁中的炎症反应并导致多种十分严重的病理学后果,诸如血管壁的出血,破裂和钙化,而这些载脂的巨噬细胞通常也被称为泡沫细胞。泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化疾病进程中一个很重要的过程。在早期动脉粥样硬化斑块中,从单核细胞分化而来的巨噬细胞逐步成熟并开始摄取低密度脂蛋白(LDL)和修饰的低密度脂白,例如氧化性低密度脂蛋白。而摄取了氧化性低密度脂蛋白的巨噬细胞随即转化为泡沫细胞,这些细胞随后会被进一步被激活成为动脉粥样硬化的中心。然而,对于泡沫细胞形成机制的研究还不够全面和深入,还有很多问题需要研究和探索。溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPA)是一种简单的磷脂,它可以在多种活细胞中发挥其生物学作用。根据已有研究显示,LPA在动脉粥样硬化斑块伤口中大量积累,而血浆中LPA的水平升高也可影响内皮细胞(ECs)、平滑肌细胞(SMCs)、单核细胞和巨噬细胞的分化功能,进而影响血管细胞的生理和病理功能,从而促进和影响血管疾病的进程。在动脉粥样硬化病程中有另外一种重要的诱导剂,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),也被称为内毒素,其具有多种生物学活性并且为革兰氏阴性菌感染后所造成病理后果的主要原因。作为革兰氏阴性细菌外膜中高度炎症成分,LPS可以诱导体外巨噬细胞形成泡沫细胞并在体内造成动脉损伤,加速动脉粥样硬化的形成。然而,对于LPA与LPS在巨噬细胞形成泡沫细胞过程中的具体诱导机制还不清楚。本研究旨在探索在动脉粥样硬化疾病形成过程中,LPA与LPS诱导巨噬细胞形成泡沫细胞与巨噬细胞迁移通路中的调控机制。在本研究中,首先发现在巨噬细胞中溶血磷脂酸(LPA)增强了脂多糖(LPS)诱导的氧化性低密度脂蛋白(ox LDL)的摄取,加速了泡沫细胞的形成。在接下来的实验中的结果表明LPA与LPS大量诱导CD14信使RNA与蛋白的表达。CD14作为LPS受体中的一员,其在LPA诱导的生物学功能中的作用还不是十分明确。因此,通过实验探究CD14在LPA信号通路中的作用。在巨噬细胞中对CD14进行基因敲低后,LPA与LPS诱导的ox LDL的摄取几乎被完全抑制,这表明在巨噬细胞中发现了CD14对于LPA与LPS诱导的ox LDL摄取/泡沫细胞的形成起到了调控作用。为了进一步探究CD14调控这一过程的分子机制,通过实验,发现LPA与LPS显著诱导了清道夫受体AI(Scavenger receptor AI)的表达,而SR-AI已被报道在巨噬细胞源性泡沫细胞的形成中过程起着重要的调控作用。随后,通过抑制CD14的表达水平,显著阻断了LPA与LPS诱导的SR-AI蛋白表达。接下来通过使用可将SR-AI功能阻断的特异性中和抗体,阻断了泡沫细胞的形成。通过实验表明SR-AI是作为CD14的下游介质调控LPA与LPS诱导的泡沫细胞形成。了解CD14与SR-AI在LPS诱导的泡沫细胞形成中的调控作用后,下一步探究是否存在更上游的分子调控CD14-SR-AI通路。根据相关研究显示,丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)在动脉粥样硬化病程发展中起着重要的作用。为了探究这些酶通路是否参与LPS诱导的ox LDL摄取/泡沫细胞形成,我们采用了药物与基因敲低的方法。当使用c-Jun N端激酶(JNK)通路的抑制剂,SP600125,显著的抑制LPS诱导的ox LDL摄取,而使用细胞外调节激酶(ERK)MEK1/2通路抑制剂,U0126,与p38通路抑制剂,SB203580,则没有显著的效果,表明JNK通路为LPS诱导的ox LDL摄取/泡沫细胞形成起着上游调控作用。为了探究JNK通路调控的LPS诱导ox LDL摄取是否通过CD14与SR-AI介导,评估了JNK通路抑制剂对于LPS诱导的CD14与SR-AI表达的调控作用。实验结果表明JNK通路抑制剂显著的抑制了LPS诱导的CD14与SR-AI蛋白表达。最后,为更深入探究JNK通路的调控机制,我们使用了针对不同JNK亚型的si RNA。通过实验结果发现,针对JNK1的基因敲低有效的阻断了LPS诱导的CD14/SR-AI表达与泡沫细胞形成,而JNK2则无有效的作用。表明了JNK1蛋白在JNK通路起到了主要的调控作用。此外,在早期的动脉粥样斑块病程中,斑块处的巨噬细胞具有向外迁移的能力,而这个过程称之为移出(emigration)。在巨噬细胞转化为泡沫细胞后,巨噬细胞会逐渐丧失移出的能力,加速动脉粥样硬化的进程。越来越多的研究显示,巨噬细胞在移出与滞留(retention)间的失衡会加剧巨噬细胞在动脉粥样斑块的积累。在这部分的研究中,实验结果表明LPA会显著阻断LPS诱导的巨噬细胞迁移,并且在骨髓巨噬细胞中LPA会阻断LPS诱导的AKT磷酸化活性。研究表明AKT家族包含包含AKT1、AKT2与AKT3三个亚型,不同AKT亚型在多种细胞的迁移过程中起着重要的调控作用。为了探究AKTs在巨噬细胞迁移过程中的调控作用,我们使用了基因敲低的实验方法。通过实验发现LPA显著阻断了LPS诱导的AKT2与AKT3的磷酸化,AKT2与AKT3水平的降低也阻断了LPS诱导的巨噬细胞迁移。为了进一步探究LPA阻断巨噬细胞迁移的分子机制,通过实验从野生型小鼠与LPA1-3受体敲除小鼠中提取分离了骨髓巨噬细胞,并为LPA4-6设计了特异性的si RNA。研究表明LPA通过LPA5与LPA6阻断了LPS诱导的AKT2与AKT3磷酸化,并对巨噬细胞的迁移进行抑制。因此,新型LPA-LPA5/LPA6-AKT2/AKT3细胞信号通路,对于巨噬细胞在动脉粥样硬化移出过程具有重要参考意义。综上所述,研究表明LPA与LPS,在动脉粥样硬化形成中的泡沫细胞形成与巨噬细胞移出过程中起着调控作用。通过对其诱导细胞信号通路进行研究,实验结果表明:CD14为连接LPA与LPS通路的新型介导分子,也是作为调控LPA与LPS所诱导的泡沫细胞形成的关键介质。而JNK1为巨噬细胞中调控CD14与SR-AI表达的上游分子,CD14与SR-AI集合对于巨噬细胞ox LDL摄取/泡沫细胞形成过程起着重要的调控作用。除去LPA对于LPS诱导的泡沫细胞形成的增强作用外,LPA对于巨噬细胞的迁移具有阻断作用。AKT2与AKT3介导巨噬细胞的迁移,而LPA通过LPA5/LPA6受体集合调控AKT的磷酸化从而抑制巨噬细胞的迁移。因此新型LPA/LPS-JNK1-CD14-SR-AI泡沫细胞信号通路,以及LPA-LPA5/LPA6-AKT2/AKT3巨噬细胞迁移通路,为动脉粥样硬化研究提供一个新的研究方向与治疗靶点。