论文部分内容阅读
本研究通过体外原代犊牛肝细胞，运用RNA干扰（RNAi）和过表达技术，构建了腺病毒介导的PTEN干扰和过表达载体；利用荧光定量PCR和ELISA等分子生物学方法，检测了PTEN对肝细胞中脂肪酸氧化关键酶和VLDL组装分泌主要结构蛋白/或功能蛋白转录水平、蛋白水平和酶活性的影响，验证了细胞培养液中VLDL浓度及肝细胞内TG含量的变化，探讨了PTEN对肝细胞脂肪酸代谢和VLDL组装分泌的调控机制。为进一步揭示奶牛脂肪肝的发生机理和利用基因疗法治疗该病奠定了理论基础。成功构建了腺病毒介导的过表达和RNAi载体，并获得高滴度的重组腺病毒，确定了重组腺病毒转染原代犊牛肝细胞条件，建立了重组腺病毒转染原代肝细胞的方法。体外肝细胞PTEN基因RNAi试验结果表明：1)当PTEN基因表达被下调后，可显著降低脂肪酸活化关键酶ACSL的mRNA表达量、蛋白翻译水平及酶活性（p<0.01）；降低脂肪酸跨膜转运关键酶CPTⅠ和CPTⅡ mRNA表达量、蛋白翻译水平及酶活性，其中CPTⅠ酶活性降低极显著（p<0.01）；β-氧化过程关键酶CAD、HADH、ECH和TH mRNA表达量均降低（p<0.01）,HADH蛋白表达量降低（p<0.05），CAD、HADH、ECH酶活性均降低（p<0.05）。过氧化物酶体脂肪酸氧化关键酶ACO mRNA表达量及酶活性升高（p<0.01）。2) PTEN基因表达被下调后,RNAi组VLDL组装分泌相关的结构蛋白或功能蛋白ApoB100、ApoE和MTP mRNA表达及蛋白水平降低极显著（p<0.01），LDLR mRNA表达及蛋白水平降低显著（p<0.05）。培养液中VLDL浓度降低（p<0.05），而肝细胞内TG含量升高（p<0.05）。体外肝细胞PTEN基因过表达试验结果表明：1）当过表达PTEN基因后，可升高脂肪酸氧化过程第一步关键酶活化酶ACSL的mRNA表达量、蛋白翻译水平及酶活性（p<0.01）；升高脂肪酸转运关键酶CPTⅠ（p<0.05）和CPTⅡ（p<0.01）mRNA表达量、蛋白翻译水平及酶活性，只升高β-氧化过程关键酶CAD、HADHmRNA表达量（p<0.01）,HADH蛋白表达量升高（p<0.05），ECH和TH mRNA及蛋白水平不受过表达PTEN的调控。CAD、HADH酶活性升高（p<0.05）。过氧化物酶体脂肪酸氧化关键酶ACO mRNA表达量及酶活性降低（p<0.01）。2)过表达PTEN基因后, RNAi组VLDL组装分泌相关的结构蛋白或功能蛋白ApoB100、ApoE和MTP mRNA表达及蛋白水平升高极显著（p<0.01），LDLRmRNA表达及蛋白水平变化不显著（p>0.05）。培养液中VLDL浓度显著升高（p<0.05），而肝细胞内TG含量降低（p<0.05）。上述结果说明：PTEN可通过升高或降低脂肪酸氧化和VLDL组装分泌关键蛋白的转录和翻译水平，调控脂肪酸在肝细胞内的氧化代谢和VLDL组装分泌，PTEN是肝细胞脂肪沉积重要调控因子，有望成为基因疗法治疗奶牛脂肪肝的靶基因。