论文部分内容阅读
目的:多氯联苯属于持久性有机污染物,在环境和人体中广泛存在,已有研究表明多氯联苯对机体有多种毒性作用。多氯联苯进入机体内会迅速代谢为羟基多氯联苯,OH-PCBs的浓度占人体PCBs总水平的10-30%,往往高于许多单个PCB同系物,是多氯联苯产生毒性的重要物质基础,因此,我们阐述羟基多氯联苯的毒性机制更有意义。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UGTs）是重要的II相代谢酶,能代谢体内多种内源性小分子（如雌激素、胆汁酸、胆红素等）,维持机体正常的生理平衡。本研究旨在探究羟基多氯联苯对多种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶亚型活性的抑制作用,试图从代谢毒理学角度阐明羟基多氯联苯的毒性机制。方法:模拟体内化合物的代谢环境,选取35种代表性的羟基多氯联苯和9种主要人类UGTs（UGT1A1、1A3、1A6、1A7、1A8、1A9、1A10、2B7和2B17）作为实验组,溶剂二甲基亚砜作为实验的空白对照,以重组UGTs催化4-甲基伞形酮（4-MU）为探针反应,通过体外孵育实验,对其代谢产物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷（4-MUG）进行定量分析。通过比较不同氯原子数量和羟基位置的OH-PCBs对UGT各亚型的抑制能力,观察OH-PCBs与UGT各亚型之间存在的复杂结构-活性关系。以2’-OH-PCB106、4’-OH-PCB106为代表OH-PCBs,以UGT1A1、-1A7、-2B7为代表UGT亚型,进行抑制动力学测定,判断抑制类型和抑制参数Ki,进一步采用体外体内外推法评估计算羟基多氯联苯暴露对体内内源性物质代谢的抑制能力。最后,本研究采用分子对接从空间结构上进一步阐明相似结构的OH-PCBs化合物4’-OH-PCB9、4’-OH-PCB26、4’-OH-PCB112、4’-OH-PCB165对UGT1A1的抑制差异,包括氢键和疏水相互作用。结果:OH-PCBs对UGTs亚型有广泛抑制作用,当使用90%的抑制率作为初始筛选阈值时,许多OH-PCBs在这个抑制范围内。所以我们选取具有代表性的两组羟基多氯联苯和三种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶进行抑制动力学测定,2’-OH-PCB106对UGT1A1、UGT1A7和UGT2B7的半数抑制浓度(IC50)分别是1.60μM、15.02μM和2.76μM;4’-OH-PCB106对UGT1A1、UGT1A7和UGT2B7的半数抑制浓度(IC50)分别是1.56μM、30.47μM和5.51μM。2’-OH-PCB106和4’-OH-PCB106对UGT1A1、UGT1A7和UGT2B7均为竞争性抑制作用。2’-OH-PCB106对UGT1A1、UGT1A7和UGT2B7的抑制动力学参数（Ki）分别是0.4μM、1.3μM和2.7μM;4’-OH-PCB106对UGT1A1、UGT1A7和UGT2B7的抑制动力学参数（Ki）分别是0.7μM、6.8μM和4.8μM。根据公式,以[I]/Ki的比值大于0.1作为羟基多氯联苯抑制内源性物质代谢的标准,2’-OH-PCB106对UGT1A1、UGT1A7和UGT2B7的阈值分别是0.04μM、0.13μM和0.27μM;4’-OH-PCB106对UGT1A1、UGT1A7和UGT2B7的阈值分别是0.07μM、0.68μM和0.48μM。当体内2’-OH-PCB106和4’-OH-PCB106浓度超过上述阈值时,就会使内源性物质的代谢受到抑制。对OH-PCBs和UGTs的空间结构进行分子对接,四种结构相似的羟基多氯联苯（4’-OH-PCB9、4’-OH-PCB26、4’-OH-PCB112和4’-OH-PCB165）结合UGT1A1得到的结合自由能分别为-6.25 kcal/mol、-7.89 kcal/mol、-7.41 kcal/mol和-7.29kcal/mol,即4’-OH-PCB9<4’-OH-PCB264’-OH-PCB112>4’-OH-PCB165,结果与初筛实验的抑制能力一致,这种抑制机制可以通过氢键和疏水作用来解释。结果显示:4’-OH-PCB9与UGT1A1的氨基酸残基之间形成1个氢键（TYR-312）,与LEU-81、GLY-314、PRO-290、PHE-80、THR-315和SER-287之间形成疏水性连接;4’-OH-PCB26与UGT1A1的氨基酸残基之间形成2个氢键（ASN-259）,与LEU-256、TRP-329、GLN-332和PRO-331之间形成疏水性连接;4’-OH-PCB112与UGT1A1的氨基酸残基之间形成2个氢键（GLN-332和LEU-330）,与LEU-16、SER-284、ARG-311、TRP-329和SER-13之间形成疏水性连接;4’-OH-PCB165与UGT1A1的氨基酸残基之间没有形成氢键,与PHE-79和HIS-72之间形成疏水性连接。结论:1.羟基多氯联苯（OH-PCBs）作为环境持久性有机污染物,对II相代谢酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶超家族（UGTs）有较强的广泛抑制作用,这个过程与羟基多氯联苯的性质（氯原子数量及羟基位置）密切相关,在本实验筛选的35个羟基多氯联苯中,当氯原子个数为3、4、5,羟基位于对位时,其抑制能力最强,之后,我们通过半数抑制浓度IC50和抑制动力学参数Ki进一步阐明代表性羟基多氯联苯（2’-OH-PCB106和4’-OH-PCB106）对UGTs的强抑制能力,IC50越小,则其抑制能力越强。2.羟基多氯联苯的浓度在体内超过一定阈值时,会抑制内源性物质的代谢,研究者通常以[I]/Ki的比值大于0.1作为羟基多氯联苯抑制内源性物质代谢的标准,例如,2’-OH-PCB106对UGT1A1、UGT1A7和UGT2B7的阈值分别是0.04μM、0.13μM和0.27μM;4’-OH-PCB106对UGT1A1、UGT1A7和UGT2B7的阈值分别是0.07μM、0.68μM和0.48μM。因此,我们要预防体内浓度达到此阈值,从根本上避免内源性物质的代谢受到抑制。3.羟基多氯联苯对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶具有复杂的结构活性关系,本实验借助分子对接软件,从空间构型上验证OH-PCBs对UGTs产生抑制作用的内在机制,这种作用可能是通过氢键和疏水作用引起的,其结果与初筛具有一致性,分子对接的结合自由能值越低、氢键越多、疏水作用越强,则OH-PCBs的抑制能力就越强,4’-OH-PCB26和4’-OH-PCB112有两个氢键,而4’-OH-PCB9和4’-OH-PCB165只有一个氢键,本实验结果为:4’-OH-PCB9<4’-OH-PCB264’-OH-PCB112>4’-OH-PCB165。