保守基因是一类序列保守且功能重要的基因，在进化过程中丢失保守基因可能导致适应度缺陷甚至引发相关疾病。目前对于保守基因丢失引发的适应度缺陷对生物的环境适应度产生怎样的影响也是未知的。基于前述理由，本项目采用大肠杆菌这种模式生物探索原核生物的保守基因丢失对其环境适应度的影响这一科学问题。本研究首先通过生物信息学的方法从大肠杆菌K12MG1655基因组中筛选出非必需保守基因，然后利用CRISPR/Cas9和Red同源重组技术对大肠杆菌中的非必需保守基因进行敲除，构建大肠杆菌基因丢失库，最后通过对已敲除成功的大肠杆菌基因进行生物信息学分析，找到与氨基酸代谢有关的基因，并对其进行环境适应度的研究。所得结论如下：
　　(1)大肠杆菌中非必需保守基因的生物信息分析
　　本研究从美国国家生物信息数据库（National Center for Biotechnology Information,NCBI）上收集了约3000个细菌的蛋白组序列，其中共有31门，41纲，104目，219科，并从其中随机挑选非大肠杆菌作为候选，通过蛋白质基本比对工具（Basic LocalAlignment Search Tool Protein,BLASTP）比对找出与大肠杆菌同源的序列，其中共有421个保守基因，在421个保守基因中有236个非必需保守基因，185个必需保守基因，而236个非必需保守基因的丢失率在4%-19%之间，并且丢失现象在不同的纲甚至门之间普遍存在，暗示保守基因的丢失可能是中性的。接着通过京都基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）和基因本体（Gene Ontology,GO）富集分析发现这些基因大多数与合成代谢有关，暗示了这些基因发生突变甚至丢失会对细菌生长发育有潜在影响。最后通过系统发育分析提示了这些基因虽然保守但在细菌进化过程中仍然存在基因丢失。
　　(2)大肠杆菌中非必需保守基因的敲除
　　本研究利用金门克隆（golden gate）技术将含有CRISPR/Cas9、Red重组蛋白、同源臂、小型向导RNA（small guide RNA,sgRNA）四个载体片段有机的结合到一起，从质粒载体连接的凝胶电泳图以及通过连接成功的质粒载体测序图谱可以看到质粒载体上无功能区域的突变，说明该连接方法对于大规模的质粒载体连接是稳定且可以实现的。从多个基因诱导敲除实验结果可以看到利用阿拉伯糖启动子诱导Cas9蛋白和Red重组蛋白的翻译和表达是可行的，并且敲除后的大肠杆菌并未完全死亡说明对于保守性的非必需基因敲除方法是可行的。以上整个实验结果说明大规模的构建保守非必需基因敲除质粒以及对保守非必需基因敲除实验方法是稳定且有效的。
　　(3)敲除型大肠杆菌环境适应度的研究
　　在本研究中，通过KEGG富集和GO富集分别从70种敲除大肠杆菌中筛选出11个与氨基酸代谢有关的基因，并在不同的碳源和温度下进行了培养。通过比较不同碳源下大肠杆菌的生长曲线可以得出，基因b0072、b0073可能参与甘油进入糖酵解途径中第一步甘油激酶的催化或者第二步反应中α-磷酸甘油的脱氢化；基因b2329、b3771、b3960可能参与糖酵解及之后的代谢途径，说明基因b2329、b3771、b3960可能是参与大肠杆菌代谢途径中重要且不可替代的基因；而其他基因在不同碳源条件下对大肠杆菌均有不同的影响。
　　通过比较不同温度下大肠杆菌的生长曲线可以得出，基因b2414的丢失仅在温度为30℃时对大肠杆菌有较强影响，在其他温度下对大肠杆菌的生长无影响。
　　综上所述，本研究成功地构建了80种保守非必需基因的敲除载体，并且已成功地在大肠杆菌K12MG1655中敲除了70种保守非必需基因；在不同碳源和温度下研究了11种保守非必需基因的功能，为认识这些基因在生物进化中的作用提供了重要信息。