RGMb为RGM家族成员之一,作为BMP2/4的辅助受体,可增强BMP信号系统的转导。而BMP成员可参与调控子宫的机能。主产于我国江浙沪区的湖羊是世界著名的多胎绵羊。本研究首先应用qPCR与IHC技术检测RGMb在湖羊机体内的表达与定位;然后,应用qPCR与WB技术研究限饲对RGMb与BMP系统成员表达的影响;最后,应用细胞转染等技术,研究RGMb对子宫内膜腺细胞的作用及其机制。主要内容如下:1.RGM 基因在湖羊机体的表达及RGMb蛋白在子宫中的定位研究为了研究湖羊RGMbCDS区序列,以妊娠D110湖羊子宫RNA为模板,应用RT-PCR综合测序检测湖羊RGMb序列;为了研究RGMb基因在湖羊机体组织中的表达情况,以3月龄湖羊为对象(n=3),应用qPCR检测肾脏、下丘脑、卵巢与子宫等15种组织中的RGMb mRNA表达水平;为了研究RGMb蛋白在湖羊子宫中的定位,应用IHC检测RGMb蛋白在湖羊3月龄、7月龄黄体期及妊娠110 d子宫中的定位。将测序得到的目的序列与小鼠、大鼠、猪、牛比对,结果显示:其同源性均高达80%以上。RGMb在湖羊卵巢、子宫等14种组织中表达,以RGMb在下丘脑的相对表达量(RGMb/GAPDH)为1,RGMb在子宫中的相对表达量大于0.5;RGMb蛋白强表达于3月龄、7月龄及妊娠110 d湖羊子宫内膜腺上皮与腔上皮细胞,弱表达于肌环。结论:RGMb在湖羊子宫中表达与定位,为进一步研究RGMb参与湖羊子宫机能的调控提供理论依据。2.限饲对湖羊子宫RGMb基因及BMP系统成员表达的影响为了探讨限饲对湖羊子宫RGMb基因及BMP系统成员表达的影响。选取妊娠35d湖羊分为两组,对照组(C)自由采食,限饲组(R)饲喂50%的自由采食量,妊娠110d取其子宫组织(n=8),应用qPCR和WB检测BMP2、BMP4、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2 与 RGMb 的表达。结果显示:RGMb 蛋白在限饲组(R)的湖羊子宫中较对照组(C)显著下降(P<0.05),但mRNA水平则无显著变化(P>0.05);限饲组(R)湖羊子宫中的BMP2与BMP4 mRNA水平较对照组(C)显著上升(P<0.05),而BMP受体BMPR1A、BMPR1B与BMPR2 mRNA水平较对照组显著下降(P<0.05)。结论:限饲影响子宫组织BMP系统成员尤其是RGMb蛋白的表达。3.下调RGMb对子宫内膜腺细胞Ishikawa的作用及机制研究为了研究RGMb对子宫内膜腺细胞的作用及其分子机制,以siRGMb转染子宫内膜腺细胞系(Ishikawa),应用CCK-8技术检测RGMb对Ishikawa细胞活力的影响;同时应用WB检测MAPK信号通路成员的表达。结果显示:敲减RGMb表达显著降低Ishikawa细胞的活力(P<0.05)和p-ERK1/2蛋白的表达水平(P<0.05),但对p-P38MAPK蛋白表达水平无影响(P>0.05)。结论:RGMb影响Ishikawa细胞的增殖与p-ERK1/2的表达,为进一步研究RGMb调控子宫机能的分子机制提供理论依据。