诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,i PSCs)来源于体细胞的重编程,与胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)相比具有很大的优越性:无需破坏胚胎,可完全避免伦理之争。然而,截至目前,i PSCs的研究尚存在几大难题:1)安全性差;2)效率低;3)耗时长。鉴于此,本研究引入了磁性纳米技术,旨在建立一种安全性高、效率可观、耗时较短的获取i PSCs的新方法。首先,将四个人源化转录因子基因(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)分别整合入四个p EGFP-N1载体,形成四种重组质粒,然后利用聚乙烯亚胺(Polyetherimide,PEI)表面修饰后的磁性纳米颗粒(Poly-MAG)与其偶联,转染293T细胞,以表达四个重组蛋白,再通过G418筛选阳性克隆并增殖培养,然后提取于纯化阳性细胞内表达的重组蛋白。并再次利用Poly-MAG与这些重组蛋白结合,提高其导入体细胞的效率,在这些重组蛋白进入广西巴马小型猪耳成纤维细胞以后发挥重编程逆转化的作用,以获得i PSCs。应用此方法可以避免因病毒转染以及引入外源基因而导致的致瘤风险。与单纯利用细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides,CPPs)技术介导重组蛋白进入被诱导体细胞发生重编程的方法相比较,应用与磁性纳米技术相结合诱导出现i PSCs的时间更短、效率更高。主要研究结果如下:试验一:广西巴马小型猪皮肤成纤维细胞的分离方法及培养体系优化为了挑选生长性能良好的广西巴马小型猪皮肤成纤维细胞作为靶细胞进行重编程逆转化试验,本研究采用5种不同方法(4种酶消化法和1种组织块培养法)分离成纤维细胞,通过比较细胞数和细胞死亡率,筛选出适宜的分离方法,并比较了小型猪不同部位(耳部、腿部、腹部、背部和尾部)皮肤组织获取成纤维细胞的差异性。结果表明:(1)采用先加0.25%胰蛋白酶消化30min,再加0.2%胶原蛋白酶消化30min的方法所获成纤维细胞数量显著高于其他处理组(p<0.05),死亡率与0.125%胰酶消化60min处理组之间差异不显著(p>0.05),但显著低于其他酶消化处理组(p<0.05);(2)利用组织块培养法,4天后即可从组织块边缘长出成纤维细胞,去除组织块后,经过5天,细胞汇合率可达80%,与酶消化法(细胞汇合率达80%仅耗时2天)相比,耗时更长;(3)五个不同部位皮肤中,以耳部皮肤获得细胞数最多,培养后贴壁效果最好;(4)所得耳皮肤成纤维细胞可传至10代以上,其中第3代和第4代细胞的活力最强;(5)猪耳成纤维细胞生长曲线显示,细胞在接种培养后的0~3d内处于生长潜伏期,而在3~8d内细胞呈对数生长,8d后细胞进入生长平台期,10d后细胞贴壁能力下降,呈现负增长。因此,宜选用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化30min,再加0.2%胶原蛋白酶消化30min的方法分离猪耳皮肤成纤维细胞,取培养3~8d的第3代或第4代细胞进行后续重编程试验。试验二:三种转染试剂介导重组质粒DNA进入293T细胞的条件优化本试验旨在探讨脂质体2000(Lipofectamine?2000)、PEI和Poly-MAG这三种转染试剂在结合含Oct 4基因的p EGFP-N1质粒后向293T细胞内转导的效率差异性。试验先将所提质粒进行浓度测定及琼脂糖凝胶电泳检测,然后,分别采用不同浓度的上述三种转染试剂与不同浓度的重组有Oct 4基因的p EGFP-N1偶联,转染293T细胞,以p EGFP-N1载体自带的绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因做报告基因,通过统计各个浓度的转染效率及细胞存活率,筛选出转染效率高、细胞毒性小的一种转染试剂及其最佳工作浓度。最后通过G418对转染后的293T细胞进行阳性克隆筛选,经增殖培养后提取和纯化重组蛋白,测定其浓度,并通过SDS-PAGE检测其纯度。本试验还采用普鲁士蓝染色法对293T细胞内的磁性氧化铁纳米颗粒进行了定性检测。结果表明:(1)四个转录因子基因(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)重组质粒浓度分别为:(299ng/μL、492ng/μL、500ng/μL和481ng/μL),DNA电泳条带全部吻合,且纯度高。(2)Poly-MAG、Lipofectamine?2000、PEI三种转染试剂介导含Oct4的重组质粒进入293T细胞的适宜浓度分别为:10μg/m L(磁板作用20min)、5μg/m L和40μg/m L,其转染效率分别为64.09±0.53%、63.82±2.53%和30.20±2.28%。Poly-MAG(10μg/m L,磁板作用20min)处理组的细胞存活率极显著高于PEI(40μg/m L)处理组和Lipofectamine?2000(5μg/m L)处理组,(91.75±0.62%vs 60.40±3.66%,31.10±5.58%,p<0.01)。(3)在阳性克隆的筛选试验中,当G418浓度600μg/m L和700μg/m L时,阳性克隆率分别为(86.54±2.35%vs 90.00±1.49%),二者差异不显著,但均显著高于其他处理组,(p<0.05)。(4)四种重组蛋白(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)纯化后浓度分别为:(461μg/m L,434μg/m L,615μg/m L,787μg/m L),通过SDS-PAGE检测,可见目的蛋白条带清晰,纯度高。(5)在普鲁士蓝染色试验中,10μg/m L Poly-MAG处理组中有80%以上的293T细胞可被染成蓝色。综上所述,宜选用10μg/m L Poly-MAG于磁板上作用20min的方法对293T细胞进行转染,有80%以上的细胞普鲁士蓝染色呈阳性反应,表明这些细胞内存在磁性氧化铁纳米颗粒。使用含600μg/m L或700μg/m L G418的细胞培养液对转染后的293T细胞进行筛选后GFP阳性克隆率最高(86.54±2.35%vs 90.00±1.49%)。重组蛋白提取纯化后经浓度和纯度检测,显示四个蛋白均符合后续试验要求。试验三:应用磁性纳米技术介导人源化转录因子重组蛋白重编程广西巴马小型猪耳皮肤成纤维细胞成为诱导性多能干细胞的可行性研究本试验旨在探讨磁性纳米颗粒与转录因子重组蛋白的偶联效果及其在缩短重组蛋白介导体细胞重编程时间上的可能性。本试验利用磁性纳米颗粒介导四种转录因子的重组蛋白进入广西巴马小型猪皮肤成纤维细胞,使其发生重编程,并以单纯使用四种转录因子的重组蛋白(内含9R聚精氨酸)处理猪皮肤成纤维细胞作为对照,试验中采用重组蛋白循环处理法,以便为成纤维细胞提供持续的重编程“能量”。为探究所得i PSCs样克隆的多能性,本试验采用形态学观察法,碱性磷酸酶(Alkline phosphatase,AKP)染色及Oct4免疫组织化学染色法对其进行鉴定。结果显示:使用磁性纳米颗粒偶联四种转录因子重组蛋白介导体细胞重编程获得的i PSCs克隆数(86个)显著高于单纯利用含细胞穿膜肽的转录因子重组蛋白介导体细胞重编程所获i PSCs克隆数(54个,P<0.05);从形态上看,所形成的细胞克隆紧密吸附于小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonal fibroblast cells,MEFs)饲养层上,形似“岛屿”状,且与周围饲养层细胞分界清楚,高倍镜下可见细胞克隆的核大而质少,细胞间距非常紧密,与ESCs相似。细胞克隆经AKP染液作用后,被染为红棕色;Oct4免疫细胞化学染色后呈红色,为阳性反应,表明所获得的i PSCs样克隆具有一定的多能性。此外,在重编程时间上,单纯利用含细胞穿膜肽的转录因子重组蛋白介导体细胞重编程至少需要7周以上才可形成i PSCs,使用磁性纳米颗粒偶联四种转录因子重组蛋白获得i PSCs只需要5周。结果表明,应用磁性纳米颗粒不仅可以适当提高重编程效率,而且还能缩短重编程的时间。试验四:含磁性纳米颗粒i PSCs的定位富集试验本实验旨在验证:(1)磁性氧化铁纳米颗粒是否存在于i PSCs内;(2)在磁吸作用下,含有磁性氧化铁纳米颗粒的i PSCs是否具有定位富集的能力。本研究对i PSCs集落进行了普鲁士蓝染色,观察其颜色变化;并采用外加磁场对培养有i PSCs培养瓶的下端进行吸引,检测i PSCs在瓶内的分布情况。结果显示:IPSCs能够被普鲁士蓝染成蓝色,且在外加磁场下可以发生富集现象,证明其内存在有磁性氧化铁纳米颗粒。结论:在小型猪皮肤成纤维细胞的获取中,采用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA先作用30min+再加0.2%胶原酶作用30min的联合消化法获取耳部皮肤成纤维细胞较好;借助外加磁场,利用表面修饰的磁性纳米颗粒不仅可与质粒DNA结合实现高效、低毒的细胞转染,而且还可以与转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)的重组蛋白偶联导入被诱导的细胞,提高重组蛋白介导猪体细胞重编程的效率和缩短重编程的时间;使用磁性纳米颗粒介导体细胞重编程所得i PSCs可在外加磁场下产生富集现象。应用纳米技术介导人源化转录因子重组蛋白重编程广西巴马小型猪耳成纤维细胞为i PSCs的研究结果为进一步开展临床疾病诊疗及再生医学领域研究奠定了基础。