普鲁兰酶（Pullulanase,EC 3.2.1.41）是一种淀粉脱支酶,能够专一性地作用于普鲁兰糖、支链淀粉、极限糊精中的α-l,6糖苷键,切下整个侧枝,形成直链淀粉,是淀粉加工业中的关键酶,在食品、酿造、医疗、化工等行业中也有着极大的应用需求。本研究以淀粉厂污水为原料,旨在筛选出产普鲁兰酶优势菌株,对其进行菌种鉴定,克隆出其普鲁兰酶基因并通过异源表达提高其发酵水平,研究纯化后的重组酶的酶学性质,对国内普鲁兰酶的开发和应用具有重要意义。主要研究内容如下:（1）通过以支链淀粉为唯一碳源进行初筛,普鲁兰糖培养基进一步鉴定,结合酶活力测定,从淀粉厂污水中分离筛选出一株产普鲁兰酶活力较高的菌株LK18（1.53±0.16 U/mL）。通过形态特征观察、生理生化试验、16S rDNA序列同源性分析及系统进化树构建等方法,将其鉴定为Paenibacillus puldeungensis,并命名为Paenibacillus puldeungensis LK18。（2）选取与Paenibacillus puldeungensis LK18的16S rDNA同源性较高的菌株的普鲁兰酶蛋白序列进行多序列比对,通过CODEHOP法设计兼并引物,扩增出部分普鲁兰酶编码序列。然后根据该段基因序列的比对结果,进一步设计引物扩增出全长序列pulA,该基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过生物信息学分析,该酶为I型普鲁兰酶,属于糖苷水解酶13家族。（3）构建重组表达载体pET-28a（+）-pulA,在E.coli BL21（DE3）中进行异源表达并初步探索其诱导条件,结果显示:在22℃,IPTG终浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导12 h,该重组酶的表达效果最好,酶活力可达248.52 U/mL。（4）通过镍柱亲和层析对最优诱导条件下的粗酶液进行纯化,成功分离出重组蛋白,其分子量约为76.95 kDa,测定出重组酶的比酶活达508.8 U/mg。酶学性质研究表明:该重组酶的最适反应温度为45℃,最适pH为6.0,在35℃⁴0℃或pH 6.0⁸.0条件下较为稳定。10 mmol/L的K⁺和Mg²⁺对该重组酶有激活作用,Zn²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺等对其有不同程度的抑制作用,其他离子对该酶无明显作用。以普鲁兰糖为底物时,该酶的Km值和Vmax值分别为3.69 mg/mL和384.62μmol/（min·mL）。