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乳腺癌已在全球范围内占据女性恶性肿瘤发病率首位,严重影响女性健康。研究表明,吸烟能使女性罹患乳腺癌的风险增加10%-30%。作为烟草中重要的致癌成分,尼古丁可以通过细胞表面的尼古丁受体激活胞内多条信号通路,进而诱发肿瘤细胞的侵袭转移,其中就包括肿瘤转移的上皮间质转化(EMT)过程。因此,尼古丁等烟草致癌物可能通过激活EMT过程,促进乳腺癌转移和恶变过程。EMT过程中常见的标志物,如E-cadherin、N-cadherin、Vinment等都已被证明可发生O-连接N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)修饰,提示O-GlcNAc糖基化可能参与尼古丁诱导的乳腺癌EMT过程。不同于经典的蛋白质糖基化修饰,O-GlcNAc糖基化是一种主要存在于可溶胞质和核蛋白的可逆单糖修饰。虽然已有文献报道O-GlcNAc糖基化参与了众多生理和病理过程的调节,但O-GlcNAc糖基化调控尼古丁诱导的乳腺癌转移机制尚未阐明。本文借助Western blot、RT-qPCR、蛋白质免疫沉淀以及染色质免疫共沉淀(ChIP)等实验手段,以乳腺癌细胞MCF-7、T47D、MDA-MB-231为研究对象,发现尼古丁可诱导乳腺癌细胞内蛋白质O-GlcNAc修饰动态上调。增强的O-GlcNAc修饰激活了Snail蛋白,抑制了E-cadherin表达,从而促进了尼古丁诱导的EMT过程并增强细胞迁移能力。进一步,本文证明了尼古丁通过激活己糖胺合成途径(HBP)的关键酶谷氨酰胺果糖六磷酸转氨酶(GFAT),增加糖供体尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)在胞内的积累,提高了胞内蛋白的O-GlcNAc修饰水平。通过报告基因、ChIP等实验证实了转录调节复合物CCAAT/增强子结合蛋白β(CEBPB)与C/EBP同源蛋白(CHOP)在这一过程中调节了GFAT的转录。此外,转录抑制子CHOP能够在尼古丁作用下发生O-GlcNAc糖基化,这使得CEBPB/CHOP异二聚体发生解离,继而促进CEBPB的DNA结合活性,使CEBPB结合在GFAT的启动子区并激活其转录。上调的GFAT可进一步激活HBP途径,形成正反馈,增强尼古丁诱导的EMT活化过程和乳腺癌细胞侵袭能力。此外,本文利用药物发现软件Discovery studio 4.5,以基于结构的虚拟筛选天然产物化合物库的方法,获得了一个O-GlcNAc糖基转移酶抑制剂阿曼托双黄酮(AF)。AF通过抑制OGT的酶活,降低蛋白质的O-GlcNAc修饰。分子动力学模拟实验结果表明,AF能够稳定结合在OGT蛋白的底物结合口袋中,并与口袋附近多个氨基酸形成氢键。细胞内活性检测结果表明,AF能够有效抑制蛋白质的O-GlcNAc修饰,具有良好的OGT抑制活性。总之,本文分析了尼古丁诱导前后乳腺癌细胞内O-GlcNAc糖基化的变化,阐释在尼古丁诱导下的O-GlcNAc糖基化与乳腺癌转移侵袭的关系,获得了O-GlcNAc糖基化调控尼古丁诱导的乳腺癌转移侵袭作用机制。本文还通过基于结构的虚拟筛选方法,筛选获得了一个新的天然产物类O-GlcNAc抑制剂AF,并进一步验证了其OGlcNAc修饰抑制活性。本文的研究结果为乳腺癌相关研究提供了新思路,也为OGlcNAc修饰的生物学功能研究提供了新的小分子工具。