子宫内膜癌（内膜癌）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤。传统的二分类法依据ERα表达情况将其分为I型（ERα表达阳性，雌激素依赖，分化好，对孕激素治疗有良好反应，预后较好）和II型（ERα表达阴性，非雌激素依赖，分化差，对孕激素治疗反应不良，预后较差）。然而，有高达20％的I型内膜癌复发，更有50%的II型内膜癌不复发。此外部分I型内膜癌对孕激素治疗无反应且预后较差，而少数II型内膜癌在孕激素治疗中却会出乎意料的发生反应且预后也较好。基于两者在临床上存在相当程度的交叉重叠现象，其在内膜癌治疗及诊断预后中的价值受到限制。因而，加强内膜癌发生及进展的基础研究，对内膜癌复发及转移进行早期预测、诊断及预后评估等是内膜癌研究的前沿课题，对于提高内膜癌患者生存率具有重要科学意义。　　EFEMP1(Epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein1)属于Fibulin家族的细胞外糖蛋白，其发挥致癌基因或抑癌基因作用根据肿瘤微环境而不同。其中在女性恶性肿瘤中，研究结果也存在差异。宫颈癌中证实通过促微血管形成导致肿瘤侵袭转移能力增强。而在另一雌激素依赖性肿瘤乳腺癌的研究中，EFEMP1在肿瘤组织中表达下调，发挥抑癌基因的作用。然而内膜癌中EFEMP1的作用尚未明确。　　本课题拟从四个方面进行研究：　　（1）检测内膜癌细胞及组织样本中EFEMP1的表达，并分析其与病理参数的关系；　　（2）探讨EFEMP1启动子区CpG岛甲基化与内膜癌中EFEMP1表达下调的关系；　　（3）通过上调及下调EFEMP1表达，体内外检测其对内膜癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响；　　（4）进一步探讨内膜癌中EFEMP1基因在上皮间充质转化过程中的作用及潜在机制。　　第一部分 EFEMP1在子宫内膜癌组织及细胞系中的表达　　目的：检测内膜癌细胞株及组织标本中EFEMP1的表达水平，分析与临床病理参数的关系。　　方法：利用荧光定量 PCR及 Westernblot方法检测内膜癌细胞株 Iskhikawa，RL95-2，AN3CA，KLE，SPEC-2，HEC-1B中EFEMP1mRNA及蛋白水平的表达；免疫组织化学的方法检测人正常子宫内膜，不典型增生内膜及内膜癌中EFEMP1表达，并通过免疫组织化学半定量评分分析EFEMP1表达水平及与临床病理参数的关系。　　结果：　　（1）细胞系中表达：与原代培养的正常子宫内膜细胞相比，Iskhikawa,RL95-2,AN3CA,KLE,SPEC2,HEC-1B细胞中EFEMP1mRNA表达量分别为正常内膜上皮细胞的15.1%,61.2%,16.5%,43.61%,0.56%,0.48%,均P<0.05;通过Western blot检测其在蛋白水平表达也显著降低。　　（2）组织中表达：通过免疫组化半定量评分分析显示EFEMP1表达阳性率在正常子宫内膜中为(32/40)80%，不典型增生内膜为(7/10)70%，内膜癌为(16/84)19%，在内膜癌组织中表达显著降低。　　（3）与病理参数关系：EFEMP1阳性表达率在淋巴结转移阳性内膜癌中为3.7%(1/27)，而淋巴结转移阴性内膜癌中为26.3%(15/57)，两者呈负相关，P=0.014。　　结论：EFEMP1在内膜癌细胞及组织中表达降低，且与肿瘤分期及淋巴结转移相关，提示EFEMP1可能抑制内膜癌的恶性进展。　　第二部分内膜癌中EFEMP1基因启动子区域表观遗传学改变　　目的：探讨EFEMP1启动子高甲基化与内膜癌中表达降低的关系。　　方法：应用甲基化特异性PCR(MSP)检测各株内膜癌细胞、新鲜冰冻正常子宫内膜及子宫内膜癌组织中EFEMP1启动子区域甲基化状态；亚硫酸盐修饰后测序(BSP)检测样本中EFEMP1基因启动子区域CpG岛甲基化概率；DNA甲基转移酶抑制剂（5-氮杂-2-脱氧胞嘧啶核苷即5-aza-dC）及组蛋白去乙酰化酶抑制Trichostatin A(TSA)处理内膜癌细胞，检测EFEMP1启动子区域甲基化水平，荧光定量PCR及Western blot检测EFEMP1表达变化。　　结果：　　（1）MSP：内膜癌组织中发生EFEMP1启动子区域甲基化概率为67%(65/97)，明显高于正常内膜组织10%(4/40)；在6株子宫内膜癌细胞中HEC-1B,SPEC2，AN3CA细胞中检测到EFEMP1启动子区域的甲基化条带，并且EFEMP1表达水平显著低于未检测到EFEMP1甲基化的RL95-2及KLE细胞。　　（2）免疫组织化学半定量评分分析43例内膜癌组织不同甲基化状态下EFEMP1蛋白表达水平，EFEMP1表达下降与其启动子甲基化负相关，P=0.03。　　（3）5-aza-dC及 TSA处理EFEMP1启动子区域甲基化的HEC-1B、SPEC-2及AN3CA内膜癌细胞株，可逆转EFEMP1表达水平及甲基化状态。　　（4）BSP：亚硫酸盐修饰后测序免疫组化半定量评分不同的内膜癌组织及5-aza-dC、TSA处理前后内膜癌细胞EFEMP1启动子区域CpG岛甲基化概率，HEC-1B及RL95-2细胞CpG岛甲基化概率分别为86.7%及5.3%；非甲基化的正常子宫内膜(N1)及内膜癌组织(T3)甲基化概率分别为0%及3.3%；内膜癌中免疫组化评分高组织伴随EFEMP1甲基化水平低，而内膜癌免疫组化评分低的组织EFEMP1甲基化概率高。　　结论：在子宫内膜癌中EFEMP1基因启动子GpG岛高甲基化导致其表达水平降低。　　第三部分EFEMP1对内膜癌细胞生物学行为的影响　　目的：探索EFEMP1对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭、迁移及体内成瘤能力的影响。　　方法：在子宫内膜癌细胞中转染干扰及过表达EFEMP1质粒，通过MTT、平板克隆实验、Transwell及划痕实验对各组细胞分别进行增殖、侵袭、迁移能力检测；构建过表达EFEMP1稳转细胞株通过裸鼠荷瘤实验检测EFEMP1对内膜癌细胞致瘤能力的作用。　　结果：　　(1)转染效果检测：HEC-1B细胞转染EFEMP1过表达质粒，通过G418加压筛选构建稳转细胞株，EFEMP1mRNA水平上调约500倍(P<0.01)；KLE细胞瞬时转染EFEMP1小干扰RNA，下调效率为75%；RL95-2细胞转染EFEMP1干扰质粒构建稳转株，EFEMP1 mRNA水平下调90%。　　(2)细胞增殖：细胞干扰EFEMP1表达后培养第4天显著促进RL95-2细胞增殖；细胞过表达EFEMP1后第4天开始显著抑制细胞增殖。　　(3)侵袭及迁移：与对照组相比，转染过表达EFEMP1质粒的HEC-1B细胞穿过小室的数量明显减少(P<0.05)，迁移能力降低；干扰 EFEMP1表达的RL95-2及KLE细胞穿过小室数量显著增多，其迁移能力也明显增强（P<0.05）。　　(4)内膜癌细胞中EFEMP1可抑制基质金属蛋白酶2和9的分泌，降低肿瘤侵袭能力(P＜0.05)。　　(5)HEC-1B细胞过表达EFEMP1可降低裸鼠成瘤能力，肿瘤体积及重量较对照组降低，Ki-67表达降低(P<0.01)。　　结论：EFEMP1在子宫内膜癌细胞中发挥抑癌基因作用。　　第四部分EFEMP1通过Wnt/β-catenin通路影响上皮间充质转化(EMT)过程　　目的：探讨EFEMP1对内膜癌EMT过程的调控及相关信号通路探讨。　　方法：免疫组织化学检测正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜及内膜癌中EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail及β-catenin表达水平，并分析与EFEMP1表达的相关性；子宫内膜癌细胞株中过表达及干扰EFEMP1表达检测EMT相关指标的变化；通过TGF-β诱导EMT，检测EFEMP1在EMT发生过程中的作用；利用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂及激动剂作用内膜癌细胞株，检测EFEMP1在内膜癌中影响EMT过程的相关信号通路；通过裸鼠腹腔转移模型验证EFEMP1对内膜癌细胞远处转移的影响。　　结果：　　（1）与正常子宫内膜组织相比，内膜癌中E-cadherin表达显著降低，而Vimentin、Snail及β-catenin表达明显增高，差异具有统计学意义。　　（2）内膜癌中EFEMP1表达与E-cadherin呈正相关（r=0.499，P<0.001），与Vimentin、Snail及β-catenin表达呈负相关（r=-0.164，-0.369，-0.299）。　　（3）HEC-1B细胞中过表达EFEMP1上调E-cadherin，下调Vimentin、Snail、β-catenin的表达；相反RL95-2细胞中干扰EFEMP1表达下调上皮性标志物，上调间质性标志物的表达。　　（4）TGF-β诱导EMT过程中，过表达EFEMP1抑制细胞形态由上皮性形态立方形向间质性形态如长梭形、伪足形成等转变；而干扰EFEMP1可促进细胞向间质形态的转变。　　（5）过表达EFEMP1可抑制Wnt信号通路下游靶基因Cyclin-D1及c-Myc表达，而干扰EFEMP1则促进其表达。　　（6）Wnt信号通路抑制剂XAV939及激动剂LiCl可逆转EFEMP1干扰及过表达对EMT相关蛋白表达的影响。　　（7）Wnt信号通路抑制剂及激动剂可逆转EFEMP1干扰及过表达对细胞增殖侵袭及迁移的影响。　　（8）在裸鼠腹腔转移模型中，EFEMP1过表达的HEC-1B组转移灶的形成显著少于对照组。　　结论：EFEMP1通过Wnt信号通路抑制内膜癌EMT过程。