菵草(Beckmannia Syzigachne)是一种主要分布在我国长江中下游地区,严重危害小麦和油菜的恶性禾本科杂草。精噁唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)属于乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂类除草剂,自20世纪90年代起,该药剂就被我国用于防除禾本科杂草。随着该药剂的长期使用,杂草对其的抗药性问题也逐渐凸显,菵草对该药剂的敏感性也逐渐下降。因此,明确我国长江中下游地区小麦田菵草对精噁唑禾草灵抗药性的发生情况及其抗性机理,这对科学防除抗性菵草、保障小麦产量有着非常重要的意义。因此,本文研究了稻麦轮作区小麦田不同菵草种群对精噁唑禾草灵的抗药性水平及抗性种群的交互抗性和多抗性;明确了菵草对精噁唑禾草灵抗药性的靶标酶机理;系统深入地研究了菵草对精噁唑禾草灵的非靶标抗性机理;针对发现的靶标酶抗性突变建立了快速分子检测方法;最后还研究了抗性生物型和敏感生物型个体在不同环境条件下的萌发情况。主要研究结果如下:1.菌草对精噁唑禾草灵及其它药剂的敏感性采用整株生物测定法检定了 2012年采集的30个种群、2013年采集的40个菵草种群对精噁唑禾草灵的敏感性。结果表明:2012年采集的30个菵草种群中有8个对精噁唑禾草灵产生了抗性,2013年采集的40个菵草种群中有19个对精噁唑禾草灵产生了抗性。总计70个种群中有27个种群对精噁唑禾草灵产生了抗药性,这表明所研究地区麦田菵草对精噁唑禾草灵的抗药性已经发生十分普遍,且抗药性发生越来越严重。2012年中,采自江苏常州市武进区小麦田的JCWL种群对精噁唑禾草灵的抗性水平最高,整株生物测定其ED50值相对于敏感菵草群AFCJ其抗性倍数为50.1。其次是江苏常州金坛市小麦田的JCJT种群和江苏扬州市江都小麦田JYJD种群,其抗性倍数分别为49.3和29.3。2013年中抗性水平最高的是采自江苏扬州高邮市界首村的JYJS种群,整株生物测定其ED50值相对于敏感菵草群AFCJ其抗性倍数为58.2。这些种群整株测定的ED50值已经远远高于精噁唑禾草灵的田间推荐剂量上限62 g a.i.ha-1,表明菵草对精噁唑禾草灵的抗性水平已经很高。挑选了 2012年抗性倍数最高的三个菵草种群JCWL、JCJT、JYJD,采用整株生物测定法研究了这三个种群的交互抗性和多抗性。结果表明:这三个种群对芳氧苯氧基丙酸酯类(APP)除草剂高效氟吡甲禾灵、精吡氟禾草灵、精喹禾灵、炔草酯、噁唑酰草胺,苯基吡唑啉类(PPZ)除草剂唑啉草酯,环己烯酮类(CHD)除草剂烯禾啶产生了交互抗性,未对环己烯酮类(CHD)除草剂烯草酮产生交互抗性;未对氟唑磺隆、甲基二磺隆、磺酰磺隆、咬磺草胺、乙草胺、扑草净、绿麦隆、草甘膦异丙胺盐产生多抗性。这为合理选择除草剂对抗性菵草进行化学防除提供了重要理论依据和实践指导。2.菌草对精噁唑禾草灵的靶标酶抗性机理靶标酶被认为是杂草对精噁唑禾草灵产生抗性的重要机理,本研究采用分子生物学技术研究抗性及敏感菵草种群的靶标酶ACCase氨基酸序列及其ACCase基因相对表达量的差异,同位素标记检测法研究抗性及敏感菵草种群ACCase对精噁唑禾草灵酸的敏感性。靶标酶基因序列分析表明:通过RT-PCR(逆转录PCR)和RACE(cDNA末端的快速扩增)等技术克隆得到ACCase基因全长12716 bp,对应的cDNA长度7097bp,其中包含长度为约为6960 bp的开放阅读框(ORF),编码2320个氨基酸残基。对27个抗精噁唑禾草灵菵草种群靶标酶序列进行分析,发现所有抗性种群均存在靶标位点ACCase的突变,且突变类型为以下五种:1781位由异亮氨酸突变为亮氨酸(I1781L),2027位由色氨酸突变为半胱氨酸(W2027C),2041位由异亮氨酸突变为天冬酰胺(I2041N),2078位由天冬氨酸突变为甘氨酸(D2078G),2096位由甘氨酸突变为丙氨酸(G2096A)位。这其中I2041N、D2078G、G2096A突变在菵草中为首次发现。这些位点突变是导致菵草对精噁唑禾草灵产生抗性的主要原因。靶标酶活性研究结果表明:挑选了 5个分别带有I1781L、W2027C、I2041N、D2078G、G2096A突变的抗精噁唑禾草灵菵草种群进行酶活研究。在精噁唑禾草灵不同浓度下,抗性和敏感种群的活性变化不同。尽管抗性种群的ACCase活性在精噁唑禾草灵加入后也逐步下降,但敏感种群活性下降的更剧烈,其活性被精噁唑禾草灵明显抑制。精噁唑禾草灵抑制菵草种群酶活性50%的药剂浓度,即IC50值,在抗性种群JCWL、JCMF、JCJT、JCQH、JYJD 中分别为 1.63、1.27、1.37、0.76、1.06 μM,而敏感种群的IC50值仅为0.11 μM,相对抗性倍数分别为14.8、11.5、12.5、6.9、9.6倍。这表明靶标酶活性的改变是这些种群对精噁唑禾草灵产生抗药性的重要生化机理之一。靶标酶基因表达量的研究结果显示:挑选了 5个分别带有I1781L、W2027C、I2041N、D2078G、G2096A突变的抗精噁唑禾草灵菵草种群进行靶标酶基因ACCase表达量研究。通过qPCR技术分析了敏感和抗性菵草ACCase基因的表达量的变化,发现在精噁唑禾草灵处理前后,五个抗性菵草种群中ACCase基因的表达量均高于敏感种群。由此推测,靶标酶ACCase基因在抗性菵草中的高表达也是抗性菵草对精噁唑禾草灵产生抗性的原因之一。3.菵草对精噁唑禾草灵的非靶标酶抗性机理采用整株生测法测定了细胞色素P450氧化酶系抑制剂对抗性菵草的作用,所用抑制剂为胡椒基丁醚(PBO)和1-氨基苯并三唑(ABT)。结果表明:细胞色素P450氧化酶系抑制剂PBO和ABT可提高精噁唑禾草灵对抗性种群JCWL、JCJT、JYJD的抑制效果,这表明细胞色素P450氧化酶在菵草对精噁唑禾草灵的抗性中可能发挥作用。此外,PBO和ABT虽然使这三个抗性种群对精噁唑禾草灵的敏感性升高,但其ED50值仍远远高于田间推荐剂量,这也与该抗性菵草种群本身就存在靶标抗性相符。代谢酶活性研究表明:JYJD、JCJT和JCWL种群的NADPH-P450还原酶活性在精噁唑禾草灵处理后分别为0.0901、0.0891、0.0757 nmol·min-1mg-1pro,显著高于敏感种群AFCJ 0.0145 nmol·min-1mg-1pro;采用模式底物分光光度法测定药剂处理前后抗精噁唑禾草灵菵草谷胱甘肽-S-转移酶活性的动态变化,发现精噁唑禾草灵处理后,JYJD、JCJT 和 JCWL 种群 GST 活性分别为 4.872、5.034 和 4.747 nmol·min-1.mg-1 pro,远远高于敏感种群AFCJ的GST活性(仅为0.536 nmol·min-1·mg-1 pro)。该结果从生理生化层面确定了这三个抗性菵草种群(JYJD、JCJT和JCWL)中存在着代谢抗性。虽然从生理生化层面对抗性菵草的代谢酶机理进行了研究,然而其分子机理仍不清楚。为研究菵草对精噁唑禾草灵代谢抗性的分子机制,本研究使用转录组测序、RT-PCR和RACE相结合的方法,成功分离出参与杂草代谢精噁唑禾草灵的8大代谢酶家族的333个基因。这8大代谢酶分别为细胞色素P450氧化酶,酯酶,水解酶,氧化酶,过氧化物酶,谷胱甘肽-S-转移酶,糖基转移酶和ABC转运蛋白。而后,在抗性菵草种群(JYJD、JCJT和JCWL)和敏感菵草种群AFCJ之间,对所有菵草代谢酶基因的基因表达水平和基因结构进行了分析,发现:有15个代谢酶基因在抗性种群中的表达显著高于敏感种群,包括2个细胞色素P450基因、2个酯酶基因、1个水解酶基因、2个氧化酶基因、2个过氧化物酶基因、3个谷胱甘肽-S-转移酶基因、2个糖基转移酶基因和1个ABC转运蛋白基因:有5个代谢酶基因在抗性种群中的表达显著低于敏感种群,包括2个细胞色素P450基因、1个水解酶基因(漆酶)和2个谷胱甘肽-S-转移酶基因;这其中还有5个代谢酶基因在抗敏种群之间存在结构差异,分别为 CYP87A3、Peroxidase 1、Esterase PIR7B、GST-U6、UDP-glycosyltransferase 85A2。本研究首次在杂草中建立代谢酶家族基因库,且全面系统的将菵草中的所有代谢酶家族基因进行了分析。为研究这三个抗性菵草种群中的调控机理,本研究中还构建了菵草的小RNA库,并在其中鉴定出菵草的41个已知miRNA和36个新miRNA。进一步对这些miRNA进行分析,发现有8个miRNA(5个已知miRNA和3个新miRNA)及其靶基因同菵草对精噁唑禾草灵的非靶标抗性相关,这其中4个miRNA(bsy-miR160a-5p、bsy-miR397、novel-bsy-miR-15、novel-bsy-miR-29)在抗性菵草种群中较敏感菵草中表达上调,另 4 个 miRNA(bsy-miR164a、bsy-miR408-3p、novel-bsy-miR-12、novel-bsy-miR-19)则在抗性菵草种群中表达下调。这8个差异表达的miRNA主要在植物应激反应的过程中发挥作用,这也与杂草对除草剂的抗性反应紧密相关。本研究首次在杂草中建立小RNA库,并首次在抗性杂草中研究其调控机制。这两个库的建立有助于更好的了解非靶标抗性机理,同时也可应用于其它抗性杂草的非靶标抗性研究。从调控机制中发现了菵草的bsy-miR397在抗性种群中表达较敏感种群要高,而其疑似靶基因bsy-Laccase漆酶基因则在转录组研究中发现在抗性种群中表达较低,这预示着其在抗性中可能发挥着重要的作用。在烟草的瞬时表达实验中,本研究发现bsy-miR397在转录水平上对bsy-Laccase有负调控作用,这进一步证实菵草中,漆酶正是miRNA397的靶基因。OsmiR397过表达后的转基因水稻,对精噁唑禾草灵的抗性增强;相反,使用CuSO4处理诱导bsy-Laccase基因上调表达后,抗性菵草种群对精噁唑禾草灵的抗性则显著降低。这些证据均表明菵草中的miRNA397/漆酶与其对精噁唑禾草灵抗性相关。为进一步揭示其作用机制,发现在OsmiR397过表达后的转基因水稻和抗精噁唑禾草灵菵草中,有三个转录因子(ARF5、MYB2、MYB39)和三个氧化酶/过氧化物酶基因(L-ascorbate oxidase、ubiquinol oxidase 1、peroxidase 1)的表达模式是一致的。miR397/漆酶正是和这些基因组成调控网络,共同导致抗性菵草及OsmiR397过表达后的转基因水稻对精噁唑禾草灵产生抗性。本研究中首次对抗除草剂杂草中的具体miRNA(miR397)的功能进行了研究,并揭示了其可能的调控网络;同时还首次发现代谢酶基因(漆酶)的下调同样可以增强代谢抗性。这不仅丰富了杂草对除草剂的非靶标抗性理论,还为有效防治田间的抗性杂草提供了理论基础。4.抗精噁唑禾草灵菵草种群ACCase基因突变快速检测方法的建立与应用本研究针对前期发现的抗性突变,建立了衍生酶切扩增多态性(derived cleaved amplified polymorphic sequence,dCAPS)分子检测方法,该方法可对 I1781L、W2027C、I2041N、D2078G、G2096A突变进行快速、准确的检测。本研究还首次在杂草中使用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)方法设计了五组引物,用来检测菵草中的这5个突变,该检测方法相较dCAPS方法更为快速、简便和省时。考虑到LAMP和dCAPS方法各有优缺点,本研究将这两个方法组合后,对2013年采集的19个抗精噁唑禾草灵菵草种群的抗性组成进行了研究。结果发现:在对精噁唑禾草灵抗性水平较低的JCQH、JCSD、JYQL、SHSX、JYLRQ和JCJL等种群中,突变频率均低于70%,且突变多为杂合;而在抗性水平较高的种群中,突变频率接近100%,且几乎所有的突变均为纯合。同时本研究还发现,JYZD种群由7个I2041A纯合子抗性单株和23个D2078G纯合子抗性单株组成,JYGC种群由30个G2096A纯合子抗性单株组成,JYSC群体由30个I2041A纯合子抗性单株组成,JYYT群体由30个I2041A纯合子抗性单株组成,JYJS群体由12个W2027C纯合子抗性单株和18个I2041A纯合子抗性单株组成,这5个种群中检测的30个单株均为纯合突变,但其抗性水平则明显不同。这些结果表明菵草对精噁唑禾草灵的抗药性水平与该抗性种群的突变类型、突变频率和突变纯杂合性均相关。5.抗性与敏感菵草种群生态适应性的研究本研究中获得的三对菵草材料(JYDX-1781SS和JYDX-1781RR,SHQP-2041SS和SHQP-2041RR,JYSC-2096SS和JYSC-2096RR),每一对材料均具有相同的遗传背景。这为研究生态适应性提供了理想材料。对抗性和敏感生物型菵草在不同环境条件下的种子萌发情况进行了研究,发现在温度、光照、酸碱度、盐胁迫等不同环境条件下,7个菵草生物型的最终萌发率均相似。这表明在这些环境条件下抗性生物型与敏感生物型的萌发并无显著性差异。而水势胁迫对抗性与敏感菵草种子的最终萌发率影响较大。当水势在-0.2MPa和-0.3MPa时,JYDX-1781SS生物型的最终萌发率高于JYDX-1781RR生物型。当水势在-0.4MPa时,JYDX-1781SS生物型的最终萌发率显著高于JYDX-1781RR生物型,而SHQP-2041SS生物型的最终萌发率则显著低于SHQP-2041RR生物型的最终萌发率。当水势在-0.5MPa时,JYSC-2096SS生物型的最终萌发率显著高于JYSC-2096RR生物型,而JYDX-1781RR生物型则没有萌发。此外在所有检测的条件下,JYDX-1781RR和JYSC-2096RR生物型的tG50值分别高于JYDX-1781SS和JYSC-2096SS生物型,表明这两个生物型萌发较慢。与之相反的是,SHQP-2041RR生物型的tG50值则低于SHQP-2041SS生物型,表明SHQP-2041RR生物型萌发较快。通过对菵草中EXPB7基因的表达模式进行研究,发现EXPB7基因可能与带有不同ACCase靶标酶基因突变的抗性菵草的萌发速率及对水势胁迫的响应有关。综上所述,本研究明确了我国稻麦轮作区小麦田菵草对精噁唑禾草灵的抗性概况。并明确了氨基酸序列的改变、靶标酶活性及靶标酶基因表达量的升高是菵草对精噁唑禾草灵产生抗药性的重要靶标酶抗性机理,还系统深入研究了复杂的非靶标抗性机理。为了能够更好地指导抗性治理,本研究还建立了针对菵草ACCase靶标突变的快速检测方法。最后还研究了不同抗性菵草生物型的生态适应性,并针对其萌发特性提出了适宜的治理策略。