2012年,一种被称为中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的新型冠状病毒在中东地区流行。该病毒可以引起SARS样的疾病,导致多器官功能的衰竭,在人群中造成约40%的病死率。由于MERS-CoV具有人传人的能力,因而存在在人群中大规模流行的可能性,因此,急需尽快对MERS-CoV进行深入研究,以寻找其药物设计靶点并开发相应的抗MERS-CoV药物,用于患者的临床治疗以及预防MERS-CoV潜在的大流行可能。本文对MERS-CoV S蛋白HR1和HR2所形成的六螺旋(6-HB)核心结构进行研究,分析MERS-CoV感染宿主细胞的膜融合机制。在晶体结构的基础上设计和检测衍生于MERS-CoV S蛋白的候选融合抑制剂,以用于对MERS-CoV感染的预防和治疗。我们首先下载了MERS-CoV(hCoV-EMC) S蛋白的全长氨基酸序列。通过与SARS-CoV的S蛋白进行序列比对,明确了其功能分区。包括融合肽(aa 943-982)、HR1 (aa 984-1104)、HR2 (aa 1246-1295)、跨膜区(aa1296-1318)、和胞内区(aa 1319-1353)。为了解析MERS-CoV S蛋白融合核心的晶体结构,我们通过L6(SGGRGG)连接HR1和HR2的核心区域(aa984-1062、aa 1245-1289),构建融合表达蛋白,并进一步解析其晶体。晶体结果显示,MERS-CoV的融合核心(HR1-L6-HR2)呈现典型的6-HB结构：外形呈棒状、长度约112A、直径约27A；HR1呈螺旋形平行排列为三聚体,三个HR2螺旋反向平行的附着在HR1之间形成的疏水沟。其中,6-HB的核心区域由HR1的aa 987-1062与HR2的aa 1263-1279形成。另外,HR2螺旋区域外侧的N-端和C-端区域均有疏水氨基酸与HR1形成的疏水沟相作用。另外,HR2和其相邻的两个HR1之间还能形成11条氢键,它们集中分布在HR2螺旋区域的N-端和C-端,该结构进一步稳定了HR2与HR1中央疏水沟之间的结合。基于以上结构,我们设计并合成了覆盖HR1与HR2相互作用区域的两条多肽HR1P和HR2P。通过使用Native-PAGE电泳发现,HR1P/HR2P的作用产物具有一条与HR1P和HR2P位置不同的新的电泳条带。使用SE-HPLC检测发现,HR1P和HR2P作用产物中存在一个分子量大于HR1P以及HR2P的新的检测峰。说明两者可以相互作用形成聚合物。而后,我们使用Laemmli上样缓冲液,在不煮沸的情况下进行SDS-PAGE。结果显示HR1P/HR2P复合物的大小在26 kDa左右,符合HR1P与HR2P形成的六聚物大小。圆二色谱(CD)显示HR1P/HR2P的复合物呈现高度的a-螺旋结构,且具有较强的热稳定性,Tm约87℃。以上结果证实,MERS-CoV S蛋白HRl和HR2结构域的衍生肽可以形成6-HB。提示可以以HR1P与HR2P为基础设计MERS-CoV的候选融合抑制剂。为了检测HR1 P和HR2P对MERS-CoV的抑制活性,我们设计并构建了基于MERS-CoV S蛋白的细胞-细胞融合模型。我们通过构建能同时表达MERS-CoV S蛋白以及EGFP的质粒pAAV-IRES-GFP-MERS-S,瞬转293T细胞(293T/MERS/EGFP)作为效应细胞,以能够表达DPP4的Huh-7作为靶细胞共同孵育。同时使用只表达EGFP的293T细胞(293T/EGFP)作对照。结果发现,37℃培养4h后,293T/MERS/EGFP能够和Huh-7融合。而阴性对照293T/EGFP则不会与Huh-7细胞融合。然后,我们在该系统上测定了HRIP、HR2P、T20(抗HIV-1多肽)和SC-1(SARS-CoVS蛋白的HR2多肽)的抑制活性。结果发现HR2P显示出较强的抑制效果(IC5o约0.8μM),而HR1P、T20和SC-1没有明显的抑制活性。之后,我们进一步在MERS-CoV感染Vero细胞模型上测试了抑制活性,结果显示,HR2P可显著抑制MERS-CoV的复制(IC5o约0.6/μM)；而HR1P、 T20和SC-1没有明显抑制活性。此外,HR2P还可以有效抑制MERS-CoV感染Calu-3细胞(IC50=0.6μM)。而在HFL细胞上,其效果大大降低(IC50=13.9μM)。推测可能由于MERS-CoV进入细胞的途径不同,从而导致了抑制效果的不同。另外,HR2P不能交叉抑制SARS-CoV假病毒感染293T/ACE2细胞的活性,表明HR2P是一个特异性的MERS-CoV融合抑制剂。为了确证HR2P的作用机制,我们使用假病毒进行了time-of-addition实验以及使用细胞-细胞融合模型进行了time-of-removal实验。结果显示,HR2P作用于病毒进入的早期阶段,并且靶向结合于MERS-CoV的S蛋白。为了进一步提高HR2P的抑制效果,我们进一步引入谷氨酸(E)和赖氨酸(K)/精氨酸(R)突变。我们按照i到i+4或i到i+3的方式,设计了引入两个突变T1263E、L1267R的HR2P-M1。以及7个点突变的HR2P-M2包括T1263E、 L1267K、S1268K、Q1270E、Q1271E、A1275K和N1277E。通过形成EK、KE或ER盐桥,从而增加了多肽自身的螺旋度。同时,这些突变还增加了多肽的亲水性及水溶性。圆二色谱显示,改造后多肽的α-螺旋比HR2P有所提高、与HR1P形成的复合物的α-螺旋度和Tm值也高于HR1P/HR2P,可见,引入的盐桥增加了符合物的稳定性。另外,HR2P-M1和HR2P-M2在H20中的溶解度也增加了大约68倍和1786倍。而在MERS-CoV S蛋白介导的细胞-细胞融合模型上的抑制活性也分别增加约9%和69%。综上所述,本实验解析了MERS-CoV S蛋白HRl和HR2形成的6-HB晶体结构,并在此基础之上,设计了衍生于HR1和HR2相互作用区域的多肽HR1P及HR2P。证明了两条多肽具有形成6-HB的生物活性。其中HR2P能有效地抑制MERS-CoV病毒的复制以及其S蛋白介导的细胞-细胞融合。之后我们进一步在HR2P的氨基酸序列中引入“EK(R)”突变,从而增加了多肽的稳定性、溶解性及抗MERS-CoV的活性。可见HR2P以及其改造多肽HR2P-M1和HR2P-M2具有开发成病毒融合抑制剂的潜力,以用于治疗和预防MERS-CoV的感染。