目的:砷（Arsenic,As）可以通过调控miRNA-21基因的表达,改变PTEN/mTOR通路的活性来影响肝细胞的增殖;原花青素（Grape seed proanthocyanidin extract,GSPE）能够清除细胞内过多的ROS来维持细胞内的氧化还原平衡体系进而抑制砷对肝细胞造成的氧化应激毒性。但目前关于原花青素能否通过miRNA-21/PTEN/mTOR通路抑制砷对肝细胞造成的恶性增殖的研究仍然未见报道。因此,本研究利用原花青素和砷对L-02细胞进行干预,探讨原花青素对砷诱导L-02细胞增殖的抑制效果以及miRNA-21/PTEN/mTOR通路在原花青素抑制砷致肝细胞恶性增殖中的作用,为完善原花青素的作用机制提供理论依据。方法:本次实验采用L-02细胞作为实验对象,利用As³⁺（2μmol/L）,GSPE（50mg/L）,miRNA-21 inhibitor及PTEN siRNA干预细胞24h后,检测miRNA-21、mTOR、PTEN、PI3K、AKT及PCNA、Ki-67的转录水平和翻译水平;CCK-8分析细胞活性;使用Transwell实验阐明细胞的侵袭和迁移水平,使用细胞划痕实验分析砷对细胞增殖、凋亡的影响;qRT-PCR检测As、GSPE、miRNA-21 inhibitor、PTEN siRNA对细胞内miRNA-21的表达的影响;mTOR、PTEN、PI3K、AKT及PCNA、Ki-67的蛋白表达水平采用Western Blot方法检测。实验结果采用方差分析比较多组间的差异,组间两两比较使用的是Dunnett法,所有实验均重复3次,检验水准α=0.05。结果:1.GSPE与NaAsO₂对细胞形态和活性的影响与对照组（100.787±11.505）相比,不同浓度NaAsO₂或GSPE干预细胞24小时后,2μmol/L（146.866±2.957）、6μmol/L（129.384±1.854）的NaAsO₂可以使细胞活性升高（P<0.05）,且2μmol/L的As处理细胞24小时后可以明显增加细胞活性;25mg/L（102.981±18.778）、50mg/L（93.382±18.659）的GSPE干预细胞24小时后,对细胞的形态及活性影响无统计学意义（P>0.05）,75mg/L（54.456±13.870）GSPE处理肝L-02细胞24小时后使细胞活性明显降低（P<0.05）。2.GSPE与NaAsO₂对细胞迁移侵袭能力的影响在侵袭实验中,与对照组（46.333±7.234）相比,2μmol/L NaAsO₂处理组（93.333±9.292）可以使细胞的侵袭能力显著升高（P<0.05）,单纯GSPE处理组（57.333±2.309）与对照组（46.333±7.234）相比对肝L-02细胞的侵袭能力影响无统计学意义（P>0.05）;与NaAsO₂处理组（93.333±9.292）相比,NaAsO₂与GSPE联合处理组（59.333±7.094）的细胞侵袭能力明显下降（P<0.05）。在迁移实验中,与对照组（63.333±6.658）相比,NaAsO₂处理组（90.333±11.590）可以使细胞的迁移能力明显升高（P<0.05）;GSPE处理组（51.667±6.028）对L-02细胞的迁移能力影响无统计学意义（P<0.05）);与NaAsO₂处理组（90.333±11.590）相比,NaAsO₂与GSPE联合处理组（57.333±12.741）使细胞的迁移能力明显下降（P<0.05）。3.GSPE与NaAsO₂对细胞恶性增殖能力的影响结果表明,在处理12小时下,与对照组（4.638±2.85）的划痕愈合率相比NaAsO₂处理组（18.249±5.050）的划痕愈合率明显升高（P<0.05）;而GSPE处理组（11.277±6.024）的划痕愈合率没有明显变化（P>0.05）;然而与NaAsO₂处理组（18.249±5.050）相比,NaAsO₂与GSPE联合处理组（7.248±4.829）可以使划痕愈合率明显下降（P<0.05）。在处理24小时下,与对照组（26.431±4.517）的细胞划痕愈合率相比,NaAsO₂处理组（20.709±15.083）和GSPE处理组（17.665±7.383）对细胞的划痕愈合率影响无统计学意义（P>0.05）;与NaAsO₂处理组（20.709±15.083）相比,NaAsO₂与GSPE联合处理组（21.945±6.369）对细胞划痕愈合率影响无统计学意义（P>0.05）。在处理48小时下,与对照组（30.997±2.421）的细胞划痕愈合率相比,NaAsO₂处理组（38.053±7.396）对细胞划痕愈合率影响无统计学意义（P>0.05）,但是数据呈出细胞划痕愈合率有升高的趋势;而GSPE处理组（25.809±8.469）对细胞划痕愈合率没有明显影响;与NaAsO₂处理组（38.053±7.396）相比,NaAsO₂与GSPE联合处理组（24.909±3.741）使细胞划痕愈合率明显降低（P<0.05）。4.GSPE与NaAsO₂对细胞中miRNA-21/mTOR/PTEN通路的调控作用与对照组相比,NaAsO₂可以增加miRNA-21 mRNA（2.97±0.23）的表达（P<0.05）,GSPE可以降低miRNA-21 mRNA（0.6±0.23）的表达（P<0.05）;与NaAsO₂处理组相比,As和GSPE的共同干预组降低了miRNA-21 mRNA（1.61±0.1）的表达（P<0.05）;与对照组相比,miRNA-21 inhibitor可以降低miRNA-21的表达（0.3±0.05）（P<0.05）,PTEN siRNA对miRNA-21的表达影响无统计学意义（P>0.05）;与NaAsO₂处理组相比,NaAsO₂和PTEN siRNA的共同干预组对miRNA-21的表达影响无统计学意义（P>0.05）;与NaAsO₂和GSPE的共同干预组相比,NaAsO₂、GSPE和miRNA-21 inhibitor的共同干预组显著降低了miRNA-21（0.2±0.01）的表达（P<0.05）,NaAsO₂、GSPE和PTEN siRNA的共同干预组对miRNA-21的表达影响无统计学意义（P>0.05）;与NaAsO₂、GSPE和miRNA-21inhibitor的共同干预组相比,NaAsO₂、GSPE、miRNA-21 inhibitor和PTEN siRNA的共同干预组对miRNA-21的表达影响无统计学意义（P>0.05）。与单纯对照组相比,NaAsO₂干预细胞后增加了mTOR、PTEN、p-AKT的表达（P<0.05）,对PI3K、AKT的表达没有明显的改变（P>0.05）。与单纯NaAsO₂干预组相比,NaAsO₂和GSPE的共同干预组抑制了mTOR、PTEN、p-AKT的活性（P<0.05）,然而对PI3K、AKT的表达影响无统计学意义（P>0.05）。与NaAsO₂和GSPE的共同干预组相比,NaAsO₂、GSPE和miRNA-21 inhibitor的共同干预组抑制了mTOR、PTEN、PI3K、p-AKT的表达（P<0.05）;NaAsO₂、GSPE和PTEN siRNA的共同干预组抑制了mTOR、PTEN、PI3K、p-AKT的表达（P<0.05）。5.GSPE与NaAsO₂对细胞中PCNA和Ki-67的调控作用与对照组中PCNA（0.529±0.019）和Ki-67（0.285±0.037）的蛋白表达水平相比,NaAsO₂处理组增加了PCNA（0.9±0.12）、Ki-67（0.57±0.06）的表达（P<0.05）。与单纯NaAsO₂处理组相比,NaAsO₂和GSPE的共同干预组降低了细胞中PCNA（0.7±0.08）、Ki-67（0.27±0.03）的表达（P<0.05）。与NaAsO₂和GSPE的共同干预组相比,NaAsO₂、GSPE和miRNA-21inhibitor的共同干预组降低了PCNA（0.62±0.11）的表达（P<0.05）,但是对Ki-67的水平改变无统计学意义（P>0.05）;NaAsO₂、GSPE和PTEN siRNA的共同干预组降低了PCNA（0.67±0.06）的表达（P<0.05）。结论:低剂量的NaAsO₂可以上调miRNA-21/PTEN/mTOR通路蛋白的表达,进一步使PCNA、Ki-67的表达升高,从而诱导肝细胞发生恶性增殖,而GSPE可以抑制miRNA-21的表达,进而降低PTEN/mTOR通路的活性,抑制NaAsO₂诱导肝L-02细胞恶性增殖的作用,说明GSPE可以通过miRNA-21/PTEN/mTOR通路缓解NaAsO₂致肝L-02细胞的恶性增殖。