狂犬病是一种人或其他温血动物的病毒性脑脊髓炎,在家畜和野生动物之间可以自然感染与传播,感染后一旦出现临床症状,致死率几乎100%。其病原体是弹状病毒科狂犬病毒属的狂犬病毒(Rabies virus,RABV)。狂犬病毒由一条单股负链RNA和五种结构蛋白组成,其中磷酸化蛋白P作为一种多功能的非催化活性蛋白,在病毒的转录和复制过程中发挥重要作用。迄今为止,虽然有研究表明狂犬病病毒P蛋白既能与其自身的结构蛋白相互作用,又能与宿主细胞的某些蛋白互作,并参与病毒的生活周期调控,但这方面的研究还相当有限,狂犬病毒的致病机致仍未完全阐明。本研究通过噬菌体展示技术,筛选出与狂犬病毒P蛋白相互作用的宿主核糖体蛋白L9,对其进行了体内、外验证,并深入研究了其对病毒复制的影响,为进一步阐明狂犬病毒的复制和致病机理奠定基础。1、RABV-P宿主相互作用蛋白的筛选为了进一步了解狂犬病毒的致病机制,探索P蛋白的生物学功能,首先从狂犬病毒cDNA中扩增并克隆了P基因,利用大肠杆菌表达并纯化了P蛋白;进一步通过人脑T7噬菌体展示技术,经过五轮筛选,用ELISA,BLAST对比和读码框校对等确定了13种与P蛋白相互作用的候选蛋白。2、L9与P蛋白相互作用的验证为了验证13种候选蛋白是否与P蛋白直接相互作用,构建了所有候选基因与GST标签的融合表达质粒,利用原核表达并纯化了相关融合蛋白。DOT-pull-down试验表明L9与RABV-P有明显的相互作用。通过GST-pull-down试验证明L9与RABV-P在体外可以直接相互作用。为了排除体外非特异的环境造成假阳性的结果,在细胞内表达了L9与P蛋白,通过Co-IP试验进一步证明RABV-P蛋白与L9相互作用。P蛋白与L9在细胞的什么部位相互作用?为了回答这个问题,构建了P融合绿色荧光蛋白GFP和L9融合表达红色荧光蛋白DsRed的真核表达质粒,共转HEK-293T细胞,共聚焦荧光显微镜观察结果显示P蛋白招募大多数细胞核中的L9蛋白共定位于细胞质中,显示P与L9在细胞质中有相互作用的可能。为了进一步确证以上结果在自然状态下能否发生,用rabv感染hek-293t细胞,间接免疫荧光试验显示l9与p蛋白仍然共定位于细胞质3、l9与p蛋白相互作用区域的确定为了确定l9与p蛋白的相互作用位点,利用pull-down实验进行了一系列研究。首先,将p基因做了p19-297、p52-297、p82-297、p138-297、p172-297、p1-137、p1-180andp1-218等8个截短,并分别表达、纯化相应蛋白,然后与带有gst标签的l9蛋白进行gst-pull-down试验,结果显示l9与p蛋白的138位至180位氨基酸区域相互作用。为了确证这一结果,我们构建了缺失该区域的表达质粒(pΔ138-180),通过类似的方法证明pΔ138-180蛋白不能与p蛋白结合,进一步验证了前面的结果。为了确定p蛋白在l9蛋白上的结合位点,根据l9蛋白结构,我们构建并表达了l91-39、l91-61、l91-85、l962-192、l986-192和l997-192等6个截短突变体。his-pull-down结果表明l9的n端39个氨基酸与p蛋白的相互作用无关。4、l9对rabv生物学功能的研究在细胞水平上过表达l9,通过检测rabv报告基因的表达水平研究l9对病毒复制的影响,结果表明过表达l9能够显著抑制rabv的复制(10-20倍);western-blot的结果显示p蛋白的表达量较对照下降了60-70%。为了进一步确证l9抑制rabv的复制是否具有特异性,在过表达l9的条件下测定了vsv的生长曲线,结果显示vsv的复制与对照没有显著差异。以上结果表明l9过表达能特异性地抑制rabv的复制。那么降低l9的表达或敲除l9对rabv的情况会是怎样呢?为了回答这个问题,合成了l9特异的sirna和无关rna。将sirna转染hek-293t细胞,感染rabv,结果显示干扰l9能够显著增强rabv复制(4-5倍);p蛋白表达量升高了50%以上。以上结果表明l9对rabv的复制具有重要的调节作用。5、l9与p蛋白互作干扰了rabv的转录为了确定l9与rabv互作发生在病毒生活周期的哪一步,我们检测了在l9过表达时病毒基因组rna和mrna的变化,研究其对复制或转录的影响,并用chx处理抑制细胞的翻译过程。结果显示,无论是否用chx处理细胞,过表达l9的情况下,病毒mrna和基因组rna的拷贝数均显著显著低于对照。为了确认此结果的特异性,在同等条件下以VSV为对象重复了上述试验,结果表明L9过表达与否对VSV的mRNA拷贝数无显著影响。