第一部分GPR40在癫痫患者及动物模型脑组织中的表达研究目的:检测GPR40在癫痫患者术后脑组织及癫痫小鼠模型脑组织中的表达情况。方法:1.从课題组已建立的包含了300多例难治性癫痫患者术后脑组织和100多例脑外伤减压术切除的正常颞叶脑组织的脑库中,随机选取癫痫脑组织标本20例和正常脑组织10例。2.成年雄性C57BL/6鼠,海人酸海马内注射诱导颞叶癫痫(TLE)动物模型,根据是否有反复自发性发作(SRS),分为SRS组(n=5)和non-SRS组(n=5),获取海马和皮质。3.免疫荧光检测GPR40的表达部位,免疫印迹检测GPR40的表达水平。结果:1.免疫荧光显示GPR40主要分布在海马CA1和CA3区的锥体细胞层,在癫痫病人组织和动物模型脑组织中,GPR40都不在星状胶质细胞中表达,而在神经元上表达,且与PSD95共表达。2.在癫痫患者术后脑组织中,GPR40的表达水平较对照组脑组织显著升高。3.在癫痫小鼠模型的皮质和海马中,有反复自发性发作小鼠的GPR40表达水平较无反复自发性发作小鼠显著升高。结论:GPR40与兴奋性神经元共表达,癫痫患者和癫痫动物模型脑组织中GPR40表达均显著升高,提示GPR40有可能参与了癫痫的发生发展。第二部分GPR40对两种癫痫动物模型癫痫发作的影响目的:为进一步探讨GPR40在癫痫发生发展中的作用,我们在癫痫发生发展过程中,应用GPR40选择性激动剂GW9508和选择性抑制剂GW1100,了解GPR40在海人酸模型和戊四氮慢性点燃模型中对癫痫发作的影响。方法:1.海人酸模型:成年雄性C57BL/6小鼠海马内注射海人酸(200ng)诱导癫痫持续状态,3天后经侧脑室置管每天给予GW9508、GW1100和DMSO溶剂(每组6只),连续7天。监测动物的癫痫发作情况,30天后进行海马内局部场电位记录。2.PTZ慢性点燃模型:腹腔注射阈下剂量PTZ(35mg/kg)点燃成年雄性C57BL/6小鼠,点燃前给予GW9508、GW1100和DMSO溶剂(每组12只),每隔48 h点燃1次,共15次,观察点燃过程中的发作分级。结果:1.海人酸模型中,行为学观察发现,与对照组相比,GW9508显著降低了癫痫发作频率,GW1100增加了癫痫发作频率。局部场电位记录发现,与对照组相比,GW9508降低了30分钟内癫痫样放电(SLEs)的次数和总时间,GW1100增加了SLEs的次数和总时间。2.PTZ慢性点燃模型中,与对照组相比,GW9508降低了各时间点的平均发作分级,提高了点燃过程的生存率;GW1100显示了相反的结果。结论:通过两种动物模型证实,在癫痫发生发展过程中,干预GPR40可影响癫痫发作,激动剂使癫痫发作活性减轻,抑制剂使癫痫发作活性增加。第三部分GPR40对突触传递的影响目的:利用全细胞膜片钳技术,探讨GPR40对突触传递的影响。方法:制备小鼠脑片,利用全细胞膜片钳技术记录海马CA1区锥体神经元的神经电生理,包括动作电位(AP),微小兴奋性突触后电流(m EPSC)、记录微小抑制性突触后电流(m IPSC),AMPA/NMDA比率以及成对脉冲比例(PPR)。结果:与基线水平相比,GW9508降低了动作电位的频率,GW1100增加了动作电位的频率;GW9508降低了m EPSC的频率和幅值,GW1100增加了m EPSC的频率和幅值;GPR40干预对m IPSC的频率和幅值的影响无显著差异。AMPA/NMDA比值结果发现,GW9508降低了NMDA受体介导电流的幅度,GW1100增加了NMDA受体介导电流的幅度;GPR40干预对AMPA受体介导的电流幅度的影响无显著差异。PPR在各组间无显著差异。结论:GPR40影响NMDA受体介导的兴奋性突触后传递。第四部分GPR40在癫痫发作中的作用机制目的:通过了解GPR40对NMDA受体的调节作用,以探讨GPR40调节癫痫发作的机制。方法:1.在动物实验后的脑组织中,免疫印迹法检测NMDA受体NR2A和NR2B的总蛋白和膜蛋白的表达变化。2.免疫荧光检测GPR40与NR2A和NR2B的共定位,免疫共沉淀检测GPR40与NR2A和NR2B相互作用,并采用定量免疫共沉淀检测GPR40对这种相互作用的影响。结果:1.在海人酸和PTZ实验后的脑组织中,免疫印迹结果显示,GW9508组NR2A和NR2B的膜蛋白/总蛋白比值显著减低,GW1100组膜蛋白/总蛋白比值明显升高;NR2A和NR2B的总蛋白表达量无显著变化。2.免疫荧光显示GPR40与NR2A和NR2B共定位;免疫共沉淀结果显示GPR40与NR2A和NR2B相互作用;定量免疫共沉淀结果显示,与对照相比,GW9508使这种结合减弱,GW1100使这种结合增强。结论:GPR40调节NR2A和NR2B的神经元细胞膜上的表达;这种改变可能是由于影响了GPR40与NR2A和NR2B的相互作用。