由于心肌的不可再生性,使得如何减少疾病状态下心肌细胞的损失成为研究的焦点。而凋亡被认为是多种心脏疾病过程中,心肌细胞死亡的重要形式。目前研究表明心肌细胞凋亡时,随着细胞内K+、Cl-和水的外流,细胞会发生皱缩,这一现象被称为凋亡性容积减小(apoptoticvolumedecrease,AVD)[1]。而在AVD过程中,容积敏感外向整流氯离子通道(volume-sensitivechloridechannel,VSOR)被认为是负载氯离子外流的主要通道,该通道电流又称为容积敏感氯电流(volume-sensitiveCl-current,ICl,Vol)[1],其电生理学特征主要包括:?外向整流;?高正电压依赖性失活;?对氯通道阻断剂DIDS敏感。目前有关细胞凋亡的途径一共有三条,分别为①线粒体途径;②死亡受体途径;③内质网应激。相关文献报道[2],运用细胞凋亡线粒体途径和死亡受体途径经典的激活剂STS和TNF-α均可以激活VSOR,同时介导STS激活VSOR电流的调节分子为活性氧(ROS)。然而,凋亡的另一条重要途径,内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)过程中是否有VSOR的参与,目前尚未见有相关文献报道。我们前期发现,VSOR通道的阻断剂4,4-二异硫氰基芪-2,2-二磺酸(4,4-diisothiocyanostilbene2,2-disulfonicacid,DIDS)可以减轻内质网应激的诱导剂衣霉素(Tunicamycin,Tm)造成的心肌细胞凋亡。为此我们假设在内质网应激介导的心肌细胞凋亡过程中也许VSOR同样发挥着重要作用。本研究正是基于前期工作的基础上,拟应用全细胞膜片钳技术,观察在Tm处理心肌细胞时记录的细胞膜电流是否符合VSOR的电生理学特征,并探讨ROS是否是衣霉素激活VSOR的调节分子。　　研究目的:　　1.观察衣霉素是否能够诱导心肌细胞产生电生理学特征符合VSOR的氯电流。　　3.观察在衣霉素激活心肌细胞膜VSOR电流中是否有ROS的参与。　　研究方法:　　1.原代心肌细胞的培养及分组:常规获取SD大鼠新生鼠(0-3Day)心肌细胞,进行原代爬片培养心肌细胞12小时,供膜片钳使用。实验设立阴性对照组(等渗组),正常对照组(低渗组),以及实验组(等渗+Tm组)每组相同实验重复5个细胞及以上。　　2.膜片钳全细胞电生理技术:应用膜片钳全细胞技术观察低渗及含Tm的等渗外液灌流细胞时,进行电流的记录及观察其电生理学特征。　　3.ROS的干预:利用ROS的清除剂NAC预处理后观察Tm对心肌细胞诱导VSOR电流的影响及H2O2处理心肌细胞后,观察心肌细胞膜电流的改变。　　研究结果:　　1.低渗外液灌流心肌细胞发现全细胞氯电流的幅度明显增加,+100mv时的电流密度为12.22±1.31pA/pF(n=5,P<0.05,低渗组vs等渗组),且存在正电压依赖性失活的特征。同时,I-V关系曲线表明其具有较显著的外向整流的特征。当低渗诱导的VSOR电流达到稳定状态时,利用含有DIDS的低渗外液灌流心肌细胞并记录电流。发现DIDS可以显著降低低渗诱导电流的幅度,在+40mv,+60mv,+80mv,+100mv时抑制作用最为明显,同时I-V曲线显示其外向整流的特征被减弱了,以上电生理学特征均符合VSOR。　　2.与等渗外液灌流诱导的低幅度基础氯电流相比,当用含有Tm的等渗外液灌流心肌细胞同样可以显著地增加氯电流的幅度,+100mv时电流密度为13.26±1.15pA/pF(n=5,P<0.05,衣霉素组vs等渗组),并且表现出较明显的正电压依赖性失活,以及外向整流的特征。从I-V曲线可以看出在+40、+60、+80及+100mv时电流幅度增加尤甚。而DIDS同样可以显著的抑制该电流的幅度以及相关电生理特征。证明Tm可以激活心肌细胞上的全细胞氯电流的电生理学特征与低渗诱导的VSOR电流类似。　　3.利用含有NAC(10mmol)的等渗外液灌流细胞,可以发现仅有幅度较小的基础电流。然而,当使用含有NAC+Tm的等渗灌流液灌流细胞时却未发现全细胞氯电流幅度的明显增加(n=5,P<0.05,NAC+TmvsTm)。表明NAC可以显著地抑制Tm诱导的VSORCl-电流的产生。细胞外应用H202可以直接激活Cl-电流,+100mv时电流密度为13.99±1.23pA/pF(n=5,P>0.05,TmvsH202),同Tm以及低渗诱导的Cl-电流特征相似。提示ROS参与了Tm诱导的VSOR激活。　　结论:　　1.低渗可以诱导心肌细胞产生VSOR电流,即表现出:外向整流,高正电压处呈时间依赖性失活,可被氯通道阻断剂DIDS阻断等电生理学特征。而衣霉素诱导产生的电流特征类似于低渗诱导VSOR电流。　　2.ROS的清除剂NAC预处理以及H2O2分别可以抑制和激活VSOR的电流,支持ROS参与Tm诱导VSOR电流的调控。