论文部分内容阅读
机体的氧化应激是许多疾病的诱因,多肽具有良好的抗氧化活性且安全性高已成为研究的热点。苦荞作为一种药食两用的杂粮,具有较高的营养价值,蛋白质含量丰富,氨基酸组成合理。本论文通过碱性蛋白酶水解苦荞球蛋白得到六条具有抗氧化活性的多肽,鉴定多肽序列并模拟其三维结构。通过苦荞多肽干预Caco-2细胞氧化应激模型,探究其对氧化应激状态下细胞的保护作用。并利用代谢组学,对其在氧化应激状态下的作用的机理进行了研究。主要实验结果如下:(1)通过葡聚糖凝胶G-75分离纯化蛋白粗提物得到苦荞球蛋白,碱性蛋白酶将其水解后,分析鉴定出六条分子量3000 Da以下的多肽,其序列分别为:CR-8(CTGFVAVR),LR-8(LRGENDQR),GK-10(GFIVQAQDLK)SR-12(SFFLAGQSQQGR),SR-17(SEAGVTEIWDHNTPEFR)和YR-26(YVIQPGGLLLPSYSNAPYITFVEQGR)。通过Py MOL模拟多肽的三维结构可知,六条多肽中均存在不规则卷曲及β-折叠,C端和N端结构存在一定差异性。六条多肽的DPPH及ABTS自由基清除能力存在显著差异。综合多肽的抗氧化能力及分子量,选择CR-8,LR-8,GK-10和SR-12这四条苦荞多肽进行细胞实验。(2)采用H2O2作为Caco-2细胞氧化应激诱导物,构建氧化损伤模型。通过研究细胞活性、细胞凋亡与坏死、细胞周期、总抗氧化能力T-AOC、丙二醛含量(MAD)以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性分析苦荞多肽对氧化应激状态下细胞的保护作用。研究发现:H2O2会使细胞内酶活降低,并使MDA含量升高导致细胞膜的损伤,从而导致Caco-2细胞的凋亡。而苦荞多肽的干预可以显著降低Caco-2细胞的凋亡率,提高线粒体膜电位与细胞内酶活,增加细胞的总抗氧化能力并减少脂质的过氧化,保护了细胞生理活动的正常。其中苦荞多肽CR-8对氧化损伤细胞的恢复效果最好。(3)通过软件模型拟合处理并结合代谢产物数据库查找,得到苦荞多肽CR-8干预氧化应激状态下细胞标志性差异代谢产物及其影响的代谢通路,从代谢组学角度分析苦荞活性多肽对Caco-2细胞氧化应激的干预作用。由多元统计PCA,PLS-DA及OPLS-DA分析代谢产物可知,经过苦荞多肽干预后,CR-8可以改善细胞氧化应激状态。通过S-plot得分图筛选出10种具有差异性的代谢产物,包括:L-乙酰基肉碱;L-色氨酸;乙酰亚精胺;溶血磷脂酸(20:4);溶血磷脂酸(20:3);溶血磷脂酸(16:0);泛酸;甘油磷酸乙醇胺;L-组氨酸;L-丙氨酸。由Metabo Analyst分析得到CR-8可能参与了10条代谢通路,其中贡献值最高的是甘油磷脂代谢。因此,苦荞多肽CR-8可以参与细胞内的脂肪酸代谢和氨基酸代谢等相关通路来改善细胞的氧化应激状态。