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乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒引起的一种广泛流行于世界各国的传染性疾病。随着乙肝疫苗的广泛应用、血液制品的筛选以及抗病毒治疗，乙肝的感染率已呈下降趋势，但是，乙肝病毒感染仍是全球性的公共卫生问题，乙肝仍是发展中国家的主要传染性疾病，在亚洲和非洲的部分地区仍然存在疫情。由于目前正在使用的抗病毒治疗方法很难将病毒完全从体内清除，仅可以控制病毒载量在较低水平，因此，乙肝是一种需要长期用药治疗的疾病。
恩替卡韦是一种耐药率低，抗病毒作用强的一线抗乙肝病毒口服药物。包括恩替卡韦在内的抗乙肝病毒药物必须定期服用至少2-3年，但有报道称在口服抗病毒药物过程中，63%的患者存在自行停药行为，在治疗过程中擅自停药可导致病毒反跳，出现黄疸和肝功能代谢失常以及乙型肝炎严重急性发作。此外，食物摄入对恩替卡韦的吸收有明显影响，为提高药效，需每天空腹服用，但空腹服药加重了恶心、呕吐、腹痛、腹泻、腹部不适和消化不良等不良反应。
基于以上两点，本研究将恩替卡韦开发成为缓释微球注射剂，以避免每日口服用药不便及空腹服药引起的副作用，避免因患者自行停药引起的病毒反跳，延长给药间隔，提高患者的用药顺应性。本文从以下几个方面开展了研究工作：
1. 处方前研究
在研究了恩替卡韦基本物理、化学性质的基础上，建立了准确、可靠的恩替卡韦体外分析测定方法，并对恩替卡韦原料药的晶体形态、粒度分布、在不同溶剂中的溶解度、油水分配系数等基本性质进行研究，为处方设计和制备工艺的选择提供了依据和参考。
2. 恩替卡韦微球制备工艺的筛选
采用原位沉淀S/O/W、喷雾干燥S/O和S/O/W三种不同的制备工艺制备了恩替卡韦微球，对比了不同工艺所得微球的外观、影响微球外观的因素、粒径与粒度分布、载药量、包封率以及体外释药曲线。结果表明，三种制备工艺均制备得到外观圆整、粒径相对均一的微球。其中喷雾干燥S/O法制备微球的载药量约为17%，S/O/W工艺为13%，两种工艺的包封率均在80%以上。喷雾干燥S/O法制备得到的微球粒径较小，且PLGA的粘度、型号、浓度以及喷雾干燥设备的进口温度都对微球的圆整性有一定的影响。S/O/W工艺所得微球的载药量和包封率以及体外释药受PLGA粘度和乳酸/羟基乙酸比例的影响。随着PLGA粘度的增大和乳酸比例的增大，载药量和包封率呈上升趋势，体外释药时间也随之延长。具有较高载药量和包封率、较长体外释药周期的S/O/W工艺为最佳制备工艺。
3. S/O/W法制备微球的处方与工艺优化及表征
在考查了原料药与高分子材料比例、高分子溶液浓度、油水体积比、PVA浓度等单因素对微球载药量和包封率影响的基础上，对微球处方进行了正交实验优化，得到最优处方。对微球进行了差式扫描、红外光谱、粉末X衍射和药物分布的拉曼光谱表征。结果表明，微球中的恩替卡韦可能以分子、非晶体、晶体形式存在；PLGA结构中的末端羧基可能与恩替卡韦中的氨基发生相互作用。拉曼光谱扫描药物在微球中的分布结果表明，自微球表面至微球内部，药物分布呈增多趋势，越靠近球心的位置，药物的尺寸越大。恩替卡韦微球初步稳定性试验结果表明，恩替卡韦微球应低温，避光保存。
4. 恩替卡韦微球加速释放度评价及释药机制研究
考察了不同pH的磷酸盐缓冲液及在磷酸盐缓冲液中加入一定体积的甲醇、乙腈作为释放介质对药物释放的加速效果，考察了温度对恩替卡韦微球释放的影响，并结合加速释药过程中微球SEM的形貌和分子量变化，以及动力学模拟方程，探索了恩替卡韦微球的释药机制。研究结果表明，在释药介质中加入一定浓度的甲醇或乙腈可以加速微球释药。45℃时的微球释药周期比同种溶媒37℃下的释药周期缩短一半。PLGA微球的降解与温度及分子中LA与GA的比例密切相关。本研究制备得到的恩替卡韦微球释药过程由恩替卡韦溶解扩散和微球的逐层蚀解共同控制。
5. 恩替卡韦微球体内药代动力学研究
在建立了稳定、高效的体内含量测定HPLC-MS/MS分析方法的基础上，对SD大鼠分别肌肉注射给予恩替卡韦混悬液和体外具有明显缓释作用的喷雾干燥S/O和S/O/W法制备得到的恩替卡韦微球，对比了不同时间点的血药浓度曲线，以DAS 2.0软件计算了药动学参数。MRT和T1/2等参数对比结果表明，本研究制备得到的微球在大鼠体内具有明显的缓释作用，释药周期可达56 d。
6. 恩替卡韦微球药效学研究
以HBV转基因小鼠为模型动物，以上市的恩替卡韦片剂为对照，以HBV-DNA拷贝数为指标，评价恩替卡韦微球的抗HBV效果。在整个研究周期，HBV转基因小鼠体重稳定增长，生存状态良好。HbeAg检测结果表明，三组小鼠均一直处于病毒复制周期。单次注射恩替卡韦微球与每日口服灌胃给予恩替卡韦片剂均使HBV DNA呈指数倍下降且下降的速率几乎一致，本研究制备得到的恩替卡韦微球一次注射抗HBV作用可维持42 d，具有良好的抗HBV复制的效果。
综上所述，本研究制备得到了具有较高载药量和包封率、体内外均具有较长释药周期的恩替卡韦缓释微球。经过初步的体内外评价和表征，证明其具有良好的缓释效果，与已上市口服片剂抗病毒效果相当，并可以明显降低给药次数，显著延长给药周期。
恩替卡韦是一种耐药率低，抗病毒作用强的一线抗乙肝病毒口服药物。包括恩替卡韦在内的抗乙肝病毒药物必须定期服用至少2-3年，但有报道称在口服抗病毒药物过程中，63%的患者存在自行停药行为，在治疗过程中擅自停药可导致病毒反跳，出现黄疸和肝功能代谢失常以及乙型肝炎严重急性发作。此外，食物摄入对恩替卡韦的吸收有明显影响，为提高药效，需每天空腹服用，但空腹服药加重了恶心、呕吐、腹痛、腹泻、腹部不适和消化不良等不良反应。
基于以上两点，本研究将恩替卡韦开发成为缓释微球注射剂，以避免每日口服用药不便及空腹服药引起的副作用，避免因患者自行停药引起的病毒反跳，延长给药间隔，提高患者的用药顺应性。本文从以下几个方面开展了研究工作：
1. 处方前研究
在研究了恩替卡韦基本物理、化学性质的基础上，建立了准确、可靠的恩替卡韦体外分析测定方法，并对恩替卡韦原料药的晶体形态、粒度分布、在不同溶剂中的溶解度、油水分配系数等基本性质进行研究，为处方设计和制备工艺的选择提供了依据和参考。
2. 恩替卡韦微球制备工艺的筛选
采用原位沉淀S/O/W、喷雾干燥S/O和S/O/W三种不同的制备工艺制备了恩替卡韦微球，对比了不同工艺所得微球的外观、影响微球外观的因素、粒径与粒度分布、载药量、包封率以及体外释药曲线。结果表明，三种制备工艺均制备得到外观圆整、粒径相对均一的微球。其中喷雾干燥S/O法制备微球的载药量约为17%，S/O/W工艺为13%，两种工艺的包封率均在80%以上。喷雾干燥S/O法制备得到的微球粒径较小，且PLGA的粘度、型号、浓度以及喷雾干燥设备的进口温度都对微球的圆整性有一定的影响。S/O/W工艺所得微球的载药量和包封率以及体外释药受PLGA粘度和乳酸/羟基乙酸比例的影响。随着PLGA粘度的增大和乳酸比例的增大，载药量和包封率呈上升趋势，体外释药时间也随之延长。具有较高载药量和包封率、较长体外释药周期的S/O/W工艺为最佳制备工艺。
3. S/O/W法制备微球的处方与工艺优化及表征
在考查了原料药与高分子材料比例、高分子溶液浓度、油水体积比、PVA浓度等单因素对微球载药量和包封率影响的基础上，对微球处方进行了正交实验优化，得到最优处方。对微球进行了差式扫描、红外光谱、粉末X衍射和药物分布的拉曼光谱表征。结果表明，微球中的恩替卡韦可能以分子、非晶体、晶体形式存在；PLGA结构中的末端羧基可能与恩替卡韦中的氨基发生相互作用。拉曼光谱扫描药物在微球中的分布结果表明，自微球表面至微球内部，药物分布呈增多趋势，越靠近球心的位置，药物的尺寸越大。恩替卡韦微球初步稳定性试验结果表明，恩替卡韦微球应低温，避光保存。
4. 恩替卡韦微球加速释放度评价及释药机制研究
考察了不同pH的磷酸盐缓冲液及在磷酸盐缓冲液中加入一定体积的甲醇、乙腈作为释放介质对药物释放的加速效果，考察了温度对恩替卡韦微球释放的影响，并结合加速释药过程中微球SEM的形貌和分子量变化，以及动力学模拟方程，探索了恩替卡韦微球的释药机制。研究结果表明，在释药介质中加入一定浓度的甲醇或乙腈可以加速微球释药。45℃时的微球释药周期比同种溶媒37℃下的释药周期缩短一半。PLGA微球的降解与温度及分子中LA与GA的比例密切相关。本研究制备得到的恩替卡韦微球释药过程由恩替卡韦溶解扩散和微球的逐层蚀解共同控制。
5. 恩替卡韦微球体内药代动力学研究
在建立了稳定、高效的体内含量测定HPLC-MS/MS分析方法的基础上，对SD大鼠分别肌肉注射给予恩替卡韦混悬液和体外具有明显缓释作用的喷雾干燥S/O和S/O/W法制备得到的恩替卡韦微球，对比了不同时间点的血药浓度曲线，以DAS 2.0软件计算了药动学参数。MRT和T1/2等参数对比结果表明，本研究制备得到的微球在大鼠体内具有明显的缓释作用，释药周期可达56 d。
6. 恩替卡韦微球药效学研究
以HBV转基因小鼠为模型动物，以上市的恩替卡韦片剂为对照，以HBV-DNA拷贝数为指标，评价恩替卡韦微球的抗HBV效果。在整个研究周期，HBV转基因小鼠体重稳定增长，生存状态良好。HbeAg检测结果表明，三组小鼠均一直处于病毒复制周期。单次注射恩替卡韦微球与每日口服灌胃给予恩替卡韦片剂均使HBV DNA呈指数倍下降且下降的速率几乎一致，本研究制备得到的恩替卡韦微球一次注射抗HBV作用可维持42 d，具有良好的抗HBV复制的效果。
综上所述，本研究制备得到了具有较高载药量和包封率、体内外均具有较长释药周期的恩替卡韦缓释微球。经过初步的体内外评价和表征，证明其具有良好的缓释效果，与已上市口服片剂抗病毒效果相当，并可以明显降低给药次数，显著延长给药周期。