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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以损害大脑记忆和认知功能为主的中枢神经系统变性性疾病,在老年人群中,AD的发病率仅次于心脑血管病和癌症。AD的病理学特征为大脑半球老年斑形成、神经纤维缠结和广泛性神经细胞死亡。构成老年斑的主要成分β-淀粉样蛋白(Amyloid beta protein,Aβ)在AD发病过程中起重要作用;Aβ的神经毒性作用主要包括Aβ对细胞调亡、自由基、钙稳态、胆碱能神经系统及能量代谢等方面的影响,近年来的研究表明自有基损伤可能是其主要机制。 人参皂苷Rg1是近年研究较多的一种人参单体,其主要的靶器官是中枢神经系统,现代药理学研究表明Rg1具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等作用,是人参作用于神经系统和促智的主要有效成分之一。 研究表明NF-κB是与氧化调节有关的一种转录因子,AD中与神经元内Aβ沉积有关的NF-κB活化是一种细胞保护反应。 研究内容:本课题初步探讨在可溶性Aβ25-35诱导的原代培养海马神经元AD细胞模型,Rg1保护神经元的作用与NF-κB信号传导通路是否存在联系及其相关作用机制。 方法:建立原代海马神经元细胞培养方法,用倒置显微镜进行形态学观察,用免疫细胞化学的方法鉴定海马神经元细胞的纯度,结合MTT检测细胞活力的方法,进行Aβ造模浓度和时间的选择以及人参皂苷Rg1预处理最佳浓度的选择;用激光共聚焦显微镜和Leica Confocal图像分析软件检测分析FITCPI双重标记的NF-κB在细胞内的激活程度;用硝酸还原酶法检测NO,NOS含量。数据结果以(?)±s表示,用SPSS11.5统计软件对数据进行统计分析。 结果: 1.原代海马神经元的培养与鉴定:选用出生24h以内SD大鼠,无菌分离并培养海马神经元,培养至第七天,经冷丙酮固定后,进行神经元特异性稀醇化酶(NSE)多克隆抗体免疫组化法染色鉴定,染色呈阳性的海马神经元细胞胞浆、轴突和树突呈棕褐色,胞核呈淡蓝色,占细胞总数90%以上。建立成熟的体外培养系后用于本研究。 2.Aβ造模浓度时间的选择:显微镜下观察各组细胞,发现随Aβ浓度的提高,细胞损害加重,40uM组损害较大,神经元突起明显减少,部分细胞核呈固缩状态,而正常组的细胞则生长良好。两因素方差分析表明:Aβ的浓度变化对OD值的影响有统计学意义(F值=10.481,P=0.00),时间的变化对OD值的影响无统计学意义(F值=1.624,P=2.202),这说明Aβ25-35对海马神经元细胞的神经毒性作用存在浓度—效应关系,而无时间—效应关系。各时点单因素方差分析显示:6小时40uM与0uM比较