论文部分内容阅读
目的:本实验旨在观察华蟾毒精（Cinobufagin,CBF）对人乳腺癌MCF-7细胞株的生长影响,并研究探讨其可能的分子作用机制。方法:常规体外培养人乳腺癌MCF-7细胞株,取指数生长期的细胞传代24 h后分别加入不同浓度（0.1,0.2,0.4,0.8和1.6μM）的CBF进行处理,分别继续培养24,48,72 h后,用CCK-8法检测细胞增殖活性,紫杉醇（0.02,0.04,0.08,0.16和0.32μM）作为阳性药物对照组,同时设置阴性对照组（空白组）;不同浓度（0,0.2,0.4和0.8μM）的CBF作用于MCF-7细胞48 h后,Hoechst 33258染色下,通过荧光显微镜观察MCF-7细胞的形态并分析凋亡情况;不同浓度（0,0.2,0.4和0.8μM）的CBF作用于MCF-7细胞48 h后,Annexin V-APC/7-AAD双染法下,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,PI单染下,流式细胞仪分析细胞周期;不同浓度（0,0.2,0.4和0.8μM）的CBF作用于MCF-7细胞48 h后,实时荧光定量PCR法（RT-qPCR）检测Bax和Bcl-2基因表达变化情况,Western-blot试验检测Bax和Bcl-2蛋白表达变化情况。结果:CCK-8试验结果表明CBF可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,并呈浓度和时间依赖性（P<0.05）,其24,48,和72 h的IC50（半抑制浓度）分别为0.94,0.44和0.22μM,紫杉醇对照组MCF-7细胞24,48,和72h的IC50分别为0.20,0.08和0.02μM;Hoechst 33258染色后荧光显微镜下观察,可见空白对照组为均匀弥散的蓝色荧光,而药物组细胞呈现明显不均一的亮蓝色荧光,提示CBF作用组MCF-7细胞发生了凋亡;Annexin V-APC/7-AAD双染法后,流式细胞仪所测0.2,0.4和0.8μM药物组凋亡细胞百分比分别为22.94%、50.68%和68.29%,而空白对照组凋亡细胞百分比为5.87%,结果表明CBF明显诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡,并呈浓度依赖性（P<0.05）;PI单染后,流式细胞仪分析0.2,0.4和0.8μM药物组G1细胞百分比分别为49.11%,57.54%和63.75%,而空白对照组为39.45%,提示CBF作用后的MCF-7细胞呈现G1期阻滞;实时荧光定量PCR法和Western-blot试验显示CBF作用于MCF-7细胞48h后Bax基因和蛋白表达上升,Bcl-2基因和蛋白表达下降,并呈浓度依赖性,且Bax/Bcl-2比例逐渐升高（P<0.05）。结论:CBF能抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖并使细胞呈现G1期阻滞,具有时间和浓度依赖性;CBF能促进人乳腺癌MCF-7细胞凋亡,并呈浓度依赖性,其作用机制可能与上调Bax表达和下调Bcl-2表达有关。CBF可能是一种潜在的以Bcl-2家族为作用靶点的抗肿瘤活性物质。