目的:　　自Wolff等发现裸DNA经肌肉注射可在肌细胞内表达并引入DNA疫苗概念以来，人们对DNA疫苗进行了广泛研究，取得了令人瞩目的进展。在以往广泛进行的DNA疫苗构建、接种后免疫应答（固有免疫和适应性免疫应答）或耐受，及效应产物作用机制研究基础上，虽然DNA疫苗已用于某些动物疾病的治疗，但在人类尚缺乏有效性应用。限制DNA疫苗在临床应用的主要问题是低免疫原性，接种后不能获得强有力的保护性免疫应答。为进一步探讨新的抗原提呈机制(RNA Sensors and Adaptors)，单一使用既转录mRNA又翻译Ag85A蛋白分子的Ag85ADNA质粒疫苗，尚不能证明疫苗DNA是否能通过RNA传感器从抗原提呈细胞(DC2.4)直接将抗原信息提呈给Th细胞，诱导适应性免疫应答。为此，本文进行了下面几方面的工作:　　1:设计Ag85A突变体Ag85A-M（编码基因114位、230位碱基C突变为碱基G，分别形成TAG和TGA双重翻译终止子），以期望Ag85A既表达mRNA，又能编码抗原蛋白;突变体Ag85A-M只表达mRNA，不编码蛋白。　　2:编码Ag85A基因突变体的人工合成，合成Ag85A DNA(891bp)全长抗原蛋白编码片段和突变体片段，并把片段克隆到增强型绿色荧光蛋白真核表达载体pIRES2-EGFP上。　　3:构建基因组中ROSA26位点敲进Ag85A（M)基因的稳转DC2.4细胞系DC-Ag85A-M和DC-Ag85A。　　4:考察突变体Ag85A-M和Ag85A在稳转细胞系DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中是否激活RNA传感器，是否存在一条RNA信号转导通路。　　方法:　　1:用DNAMAN8.0软件（美国Lynnon Biosoft公司开发的高度集成化的分子生物学综合应用软件，可以用于多序列比对、PCR引物设计、限制性酶切分析、质粒绘图、蛋白质分析等，几乎囊括了所有日常核酸、蛋白质序列的分析工作。）对Ag85A及突变体Ag85A-M的mRNA二级结构进行稳定性（二级结构自由能）分析。　　2:利用普通PCR法进行人工基因合成，通过把Ag85A(mutant，M)全DNA序列分别拆分成A(332bp)、B(332bp)、C(264bp)三个小片段和D(488bp)、E(423bp)两个小片段进行分段延伸、单段PCR扩增、单段插入片段制作、单段克隆、质粒转化、检菌、质粒提取、测序、PCR扩增单段基因及PCR扩增全长基因。并把全长片段通过pIRES2-EGFP载体多克隆位点(multiple clone site，MCS)中双酶切位点EcoRⅠ/BamHⅠ插入载体，构建pIRES2-EGFP-Ag85A和pIRES2-EGFP-Ag85A-M载体，进行双酶切和基因测序，构建pET28a-Ag85A和pET28a-Ag85A-M载体，进行抗原蛋白原核表达。　　3:采用CRISPR/Cas9技术ROSA26位点Ag85A突变基因敲进DC2.4细胞系的建立，通过共转染具有高活性sgRNA(small guide RNA)的CRISPR/Cas9质粒及含有目的基因的打靶载体pTg2.0-Ag85A(M)到DC2.4细胞系中，利用嘌呤霉素(puromycin，Puro)进行药物筛选，通过PCR方法筛选鉴定阳性单克隆细胞。　　4:通过实时荧光定量PCR(SYBR Green qPCR)相对定量突变体Ag85A-M及Ag85A、RNA传感器RIG-Ⅰ和Mda-5（Ifih）及适配子MAVS、IRF3、IRF7和IFNβ的mRNA表达量(Fold change)，通过蛋白免疫印迹（Western Blot）电泳探讨了Ag85A及突变体抗原蛋白、RNA传感器及适配子的蛋白表达情况，通过流式细胞仪检测细胞表面因子MHCⅡ的活化程度(M2mean)。　　结果:　　1:编码Ag85A基因突变体的设计，原始序列全序列mRNA二级结构自由能△G=-418.30kcal/mol;突变体序列二级结构自由能△G=-416.92kcal/mol，升高了3.3‰，为1.38kcal/mol，自由能变化很小，保持了Ag85A mRNA原二级结构的稳定性。114位点碱基C突变为G（TAC→TAG），原始序列局域mRNA二级结构，TAC在圆形环上;突变序列TAG也在圆形环上，局域mRNA二级结构和一级序列都没有变化（除了TAC中的C变成了G）。230位点碱基C突变为G（TCA→TGA），原始序列TCA局域mRNA二级结构在双链与七个碱基小环交接处;突变序列TGA在双链与六个碱基小环交接处，虽然碱基发生了变化，但局域mRNA二级结构变化不大。　　2:编码Ag85A基因突变体的人工合成，从A、B、C和D、E小片段克隆形成的菌落中分别随机挑取8个菌落进行质粒提取和测序，A、B、C阳性克隆率平均值为88％，基因保真度为90％;D、E阳性克隆率平均值为82％，基因保真度为23％。　　获得Ag85A DNA全长片段和突变体片段。获得pIRES2-EGFP-Ag85A和pIRES2-EGFP-Ag85A-M表达载体，酶切检测和基因测序完全正确。pET28a-Ag85A表达出抗原蛋白，而pET28a-Ag85A-M不表达抗原蛋白，与实验设计一致。　　3:采用CRISPR/Cas9技术ROSA26位点Ag85A突变基因敲进DC2.4细胞系的建立，获得目的基因序列和插入位点都正确的稳转DC2.4-Ag85A(M)细胞株。　　4:Ag85A突变体激活RNA传感器及适配子信号转导通路，突变体Ag85A-M和Ag85A mRNA表达量与空细胞DC2.4(NC)相比具有显著性升高（P＜0.0001），Ag85A-M和Ag85A之间没有显著性差异(P＞0.05);Ag85A表达抗原蛋白，而突变体Ag85A-M不表达蛋白。RIG-ⅠmRNA表达水平在稳转细胞系DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中与空细胞相比显著性升高（P＜0.0001），但DC-Ag85A RIG-ⅠmRNA表达量也显著性（P＜0.0001）高于DC-Ag85A-M;RIG-Ⅰ蛋白表达量都增加，DC-Ag85A增加的多一些。Mda-5mRNA在DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中表达量都显著性升高（P＜0.0001），DC-Ag85A-M和DC-Ag85A中Mda-5mRNA表达量也呈显著性差异(P＜0.001);Mda-5蛋白量较空细胞都有所增加。MAVS也类似，但mRNA表达量在两个细胞系中无显著性差异。IRF3与Mda-5情况类似。IRF7情况与MAVS类似。IFNβmRNA两者都显著性增加（P＜0.0001），DC-Ag85A-M增加的多一些，DC-Ag85A-M与DC-Ag85A差异不具显著性（P＞0.05）;特异性蛋白表达都增加。细胞表面分子MHCⅡ表达量较空细胞都增加，并且具有显著性(P＜0.0001)。　　结论:　　1:成功自行设计和构建了Ag85A基因突变体Ag85A-M，经实验结果证明了该突变体只转录mRNA，不表达蛋白分子。此突变体中突变区域均不是双链结构，不会影响Ag85A mRNA对RNA传感器RIG-Ⅰ的活化。　　2:本文自行设计采用Ag85A基因（全长891bp）的332bp、332bp和264bp三个片段拆分策略，利用普通PCR技术进行人工基因合成，可显著降低碱基错误率。　　3:采用最新CRISPR/Cas9基因编辑技术于ROSA26位点成功敲进Ag85A基因突变体至DC2.4细胞系，经PCR技术鉴定获得了理想的阳性细胞克隆。　　4:Ag85A突变体和Ag85A基因敲进的DC2.4细胞系内转录的mRNA均致RIG-Ⅰ和MDA-5的mRNA和蛋白表达水平均呈显著性升高，提示Ag85A突变体和Ag85A基因转录的mRNA诱导了二种RNA传感器的活化。　　5:Ag85A突变体和Ag85A基因敲进的DC2.4细胞系内MAVS、IRF3和IRF7的mRNA和蛋白表达水平均呈显著性升高，提示Ag85A突变体和Ag85A基因转录的mRNA刺激RIG-Ⅰ和MDA-5活化后，很可能是通过与MAVS、IRF3和IRF7相关的转导通路，传出Ag85A突变体基因的免疫原性信号。为此，我们认为Ag85A突变体基因敲进的DC2.4细胞系内，其编码的免疫原性传出信号通路是:dsRNA(Ag85A mRNA)→RIG-Ⅰ/MDA-5→MAVS→IRF3/IRF7→IFNβ。　　6:Ag85A突变体和Ag85A基因敲进的DC2.4细胞表面MHCⅡ与空细胞相比，反映其活化程度的M2(Mean)值显著性升高，表明MHCⅡ分子均被激活，并且具有显著性(P＜0.0001)，提示有细胞活化信号产生。　　7:Ag85A突变体基因敲进的DC2.4细胞系内IFNβ的mRNA转录水平略高于Ag85A基因敲进的DC2.4细胞系内，提示还可能存在另外一条Ag85A转录的dsRNA信号转导通路。