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5-甲基吡嗪-2-羧酸（5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid,MPCA）是重要的医药中间体,被广泛应用于降血糖药物、降血脂药物及治疗结核病药物的合成。传统的化学合成法、现有的野生菌转化法及酶催化法合成MPCA存在着环境污染,生产周期长及需要利用有毒物质二甲苯等问题,因此本研究建立了一种对环境友好的重组大肠杆菌（Escherichia coli）全细胞催化高效制备MPCA的方法。首先,为了在E.coli中构建MPCA的合成途径,克隆来源于恶臭假单胞杆菌（Pseudomonas putida）ATCC 33015编码二甲苯单加氧酶（Xylene monooxygenase,XMO）的xylM和xylA基因,编码苯甲醇脱氢酶（Benzyl alcohol dehydrogenase,BADH）的xylB基因和编码苯甲醛脱氢酶（Benzaldehyde dehydrogenase,BZDH）的xylC基因至表达载体pET28a。对菌体收集的时期、三个酶的表达量组合进行优化获得重组菌E.coli MABC1,并对其催化条件进行优化,确定最优条件为:细胞量OD600=100,pH 8.0,温度20oC,底物2,5-二甲基吡嗪（2,5-Dimethylpyrazine,DMP）浓度12 g·L-1,催化时间48 h,在这一过程中发现限制MPCA产量提高的关键酶为XMO。通过对XMO中编码电子转移蛋白的xylA基因前的RBS进行优化,获得一株正向菌株E.coli ARBS3,MPCA产量提高至10.2 g·L-1,MPCA对DMP的得率提高到0.665 mol/mol。其次,通过利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术整合MPCA合成途径至基因组并调节xylM和xylA在基因组上拷贝数的比例,构建了无质粒高产MPCA菌株E.coli MPCA8,最终产量达到15.6 g?L-1,并且MPCA对DMP的得率达到1 mol/mol,同时所需细胞量降低为OD600=75,催化时间缩短为36 h。最后,我们采用穿线法对XMO中起催化作用的受体羟化酶进行蛋白建模,利用软件Discovery Studio进行分子对接得到5个关键氨基酸位点。对这5个关键位点进行定点饱和突变后,获得催化活性提高的突变株L151F,其催化活性为67 mg·h-1·gDCW-1。对该突变株进行催化验证,MPCA产量达到11.6 g·L-1,与携带质粒的重组菌E.coli ARBS3相比有所提高。