论文部分内容阅读
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是存在于机体间质组织中的具有自我更新能力的成体干细胞。由于MSCs具有来源广泛、较强的增殖与多向分化能力以及低免疫原性等优点,已成为干细胞临床治疗的理想种子细胞。外泌体(Exosomes,Exo)是细胞通过旁分泌产生的富含microRNA及其他生物活性分子的纳米级细胞膜包裹的囊泡,通过与靶细胞融合并释放其中的microRNA等物质,从而对靶细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等生理活动进行调控。MSC-Exo在临床疾病的诊断和治疗上具有重要意义,与MSCs直接移植治疗相比,没有致敏、致癌风险,且剂量易控制。目前人和鼠等动物的MSCs研究较多,而犬MSCs研究较少,但犬作为首选家养宠物,其健康问题同样受到人们的关注。皮肤创伤是犬最常见的创伤,常规治疗方法易导致继发感染、伤口愈合时间长和形成疤痕等问题,MSC-Exo具有抑制炎症反应、加快愈合速度等优势,给皮肤损伤治疗提供了新途径。为了筛选犬临床治疗的种子细胞以及研究脐带间充质干细胞外泌体(Exosome Derived from Unbilical Cord Mecenchymal Stem Cells,UC-MSC-Exo)对皮肤和血管损伤的修复作用并阐明其机制,本实验做了以下研究:1.犬脐带、羊膜、胎盘、骨髓和脂肪五种不同来源的MSCs的生物学与转录组特性比较研究。实验分别采集和培养了犬脐带(Unbilical Cord,UC)、羊膜(Amniotic,AM)、胎盘(Placenta,P)、骨髓(Bone Marrow,BM)和脂肪(Adipose,AD)五种不同组织来源的MSC,并对其生长、成脂成骨分化、细胞表面特异标志物和转录组特性等进行比较研究。结果发现:五种不同组织来源的MSCs均呈纤维状贴壁生长,细胞表面阳性表达CD44,而不表达CD34;所有MSCs均在第3代具有最强增殖能力,AD-MSC、P-MSC、BM-MSC、UC-MSC和AM-MSC的平均群体倍增时间分别为(15.8±0.318)h,(21.2±0.629)h,(26.2±0.242)h,(35±0.588)h和(41.9±0.954)h,AD-MSC增殖活性最强;五种不同来源的MSCs均可在体外定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞,其中AD-MSC的成脂、成骨效率最高。但就产后废弃组织来源MSCs而言,UC-MSC具有较优的细胞学特性。MSCs转录组谱显示AD-MSC和BM-MSC具有最高的同源性,而P-MSC与其他四种类型的MSCs相比显著不同。由于UC-MSC具有独特的来源优势,且与其他来源于产后废弃组织的MSCs相比,具有较优特性。因此本实验选择UC-MSC-Exo作为治疗皮肤和血管损伤修复的治疗细胞。2.犬UC-MSC-Exo促进皮肤损伤的修复作用本实验采用低温超高速离心法(100,000×g离心力)从犬UC-MSC的条件培养基中分离获得外泌体。透射电镜检测显示,该外泌体直径约84 nm,呈卵圆形杯托状;Western blot检测显示,该外泌体表达表面标志蛋白CD9、CD63和CD81。提示,本实验成功分离获得犬UC-MSC-Exo。为研究间充质干细胞促进皮肤创伤修复的机制,本实验研究了UC-MSC-Exo对犬皮肤创伤的修复作用。选取年龄相近的健康中华田园犬12只,在背部正中肩胛骨下方皮肤做4 cm×4 cm正方形切口,然后随机分成治疗组和模型组,每组6只,公母对半。外泌体组在创口周围注射1 m L浓度为300μg/m L的外泌体溶液,模型组注射等量生理盐水。造模前后每天观察犬只精神状况和创面愈合情况,定时检测血常规和创口面积大小,并于第1、2、4周进行病理组织观察。结果发现,在造模后第1周,模型组出现了明显炎症反应,白细胞数量也较造模前升高了30%,而外泌体组炎症反应不明显,白细胞总数和中性粒细胞升高速度也较模型组慢;两组的淋巴细胞数和红细胞数无明显差异。外泌体组肉芽组织生长和伤口愈合速度较模型组快,但无显著性差异。结果提示,犬脐带间充质干细胞外泌体具有一定抑制炎症和促进皮肤创面愈合的作用。3.犬UC-MSC-Exo对血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cell,VEC)增殖、迁移与凋亡的调控作用。血管再生是伤口愈合的重要过程,但犬UC-MSC-Exo对血管损伤修复的作用机制尚不明确。为了研究Exo是否通过改变VEC的生物学行为促进皮肤创伤愈合,本实验采用机械剥离和I型胶原酶消化法分离犬VEC并通过表面标记和分化特性对其进行鉴定。分别使用CCK-8法、划痕实验和Annexin V流式检测法测定犬UC-MSC-Exo对VEC增殖、迁移和凋亡的影响。结果表明,犬VEC的形态呈铺路石状,细胞阳性表达CD34和CD31表面蛋白,提示本实验分离获得了犬VEC。CCK-8实验结果显示犬UC-MSC-Exo对VEC增殖具有促进作用,且这种作用与剂量呈正相关;划痕实验结果表明,犬UC-MSC-Exo能显著促进VEC迁移,在共培养24 h后,Exo组细胞迁移率较对照组增加35.56%;流式细胞术检测Exo组细胞凋亡率较对照组下降1.5%,差异极显著。以上结果提示,犬的UC-MSC-Exo能显著促进VEC增殖与迁移,抑制其凋亡。4.犬UC-MSC-Exo中非编码RNA对VEC增殖的影响及其分子机制。本实验首先将犬UC-MSC-Exo中microRNA进行测序,然后根据结果筛选出与细胞增殖相关的4个miRNA(cfa-miR-34a/-143/-181/-378),最后分别合成它们的mimic和inhibitor,转染到VEC。结果发现,cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可显著促进VEC增殖。通过Target Scan和miRBD软件对cfa-miR-34a和cfa-miR-143进行靶基因预测并运用String软件对靶基因进行KEGG信号通路分析,结果表明cfa-miR-34a可能是通过Notch通路,而cfa-miR-143可能通过P13K-Akt、ErbB和MAPK信号通路促进VEC的增殖。