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研究背景 石棉可引起严重的职业病如间皮瘤和肺癌，是一种确认的职业性致癌物之一。我国石棉资源丰富、品种齐全，但个体作坊或不规范的生产车间石棉粉尘含量常超过国标（2mg／m3），因此石棉仍然威胁我国接触工人健康的一种潜在性致癌因素。在所有的石棉中，青石棉的毒性高于温石棉，由其导致的恶性病变发病机理复杂，了解甚少，但细胞内产生的ROS和EGFR、MAPK级联激活可能发挥重要作用。 过量的ROS可引起氧化损伤，导致生物膜大分子不饱和脂肪酸发生过氧化，引起炎性反应并产生炎性早期因子IL-8。二价金属离子转运子NRAMP2可转运二价金属如铁、锌、锰、铜等，研究青石棉作用于呼吸道上皮细胞的表达状况，可了解青石棉中铁在氧化过程中的作用，并据此推论Fe2+和Fe3+相互转化中，即电子传递过程中对产生ROS的影响。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是细胞内重要的信号传导级联，用青石棉刺激肺泡Ⅱ型上皮和间皮细胞后，可激活细胞MAPK级联高表达；同时又发现MAPK级联信号依赖EGF受体的磷酸化；阻断EGF受体活性，即可以抑制ERK、MEK的表达。这些实验揭示了MAPK和EGFR信号通路在青石棉致病过程中发挥的重要作用。 研究目的 青石棉具有较强的遗传毒性。体外研究中，用石棉刺激肺间皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞的研究很多，但是有关青石棉致病过程中呼吸道上皮BEAS-2B细胞中信号传导系统的分子变化报道甚少，呼吸道上皮细胞，特别是支气管上皮郑州大学博士学位论文青石棉诱导BEAS·ZB细胞产生ROS及EGFR，MAPK级联激活的研究细胞也是青石棉作用的靶细胞，可引发支气管肺癌。研究青石棉致BEAS一ZB产生的ROS、探讨青石棉诱导BEAS一ZB细胞EGFR和MAPK激活及其信号间的调节和依赖，对研究癌变机理具有重大意义。实验方法1.培养BEAS一ZB细胞用KGM培养基在37”C、5%CO:培养箱中培养;显微镜下观 察BEAS一ZB细胞对Trypan蓝的吞噬以鉴定细胞的成活率;用细胞培养上清检 测LDH的释放，以此评价青石棉对细胞的毒性。2.细胞内ROS的测定以青石棉刺激BEAS一ZB细胞后，分别用DHE和DCF荧光探 针测定细胞内的02或OH一、HZO:和OH一等ROS水平，并使用SOD观察其阻断作 用。3.ELISA检测细胞培养上清细胞因子的释放青石棉刺激BEAS一ZB细胞后，用 EIJSA试剂盒检测细胞培养上清中细胞因子11厂8蛋白的释放。4.免疫荧光染色定位EGFR（Y 1 068） BEASZB细胞种植于Coster培养皿中，以 青石棉和EGF分别刺激细胞，用FITC结合的抗体对细胞免疫荧光染色，荧光 显微镜观察p一EGFR的定位。5.Western Blot青石棉刺激BEAS一ZB细胞后，用特异性的抗体分别测定转运子 NRAMPZ+1 RE和NRAMPZ一IRE、p一EGFI又及总EGFR、p一MEKI/2及总MEKI/2、 p一ERKI/2及总ERKI/2的蛋白的水平:用EGFR抑制剂PD153035和MEKI抑制 剂PD98059预处理BEAS一ZB，然后以青石棉刺激细胞，用特异性抗体检测p一EGFR 及总EGFR、p一MEKI/2及总MEKI/2、p一ERKI/2及总ERKI/2的表达;用抗EGFR （LAI）抗体预处理BEAS一ZB后，再以青石棉刺激细胞，分别测定p一EGFR及总 EGFR、p一MEKI/2及总MEKI/2、p一ERKI/2及总ERKI/2的水平:用表达SOD和 过氧化氢酶的腺病毒AdSOD和AdCat分别转染BEAS一ZB细胞，再以青石棉刺 激细胞，检测p一EGFR及总EGFR、p一MEKI/2及总MEKI/2、p一ERKI/2及总ERKI/2 的蛋白的水平。6.RT一PCR检测mRNA的表达用青石棉刺激BEAS一ZB细胞后，提取RNA并逆转录 形成cDNA，使用相应引物检测细胞中NRAMPZ+IRE和NRAM尸2一IRE的表达。郑州大学博士学位论文青石棉诱导BEAS一ZB细胞产生ROS及EGFR，MAPK级联激活的研究结果与分析1.BEAs一ZB细胞成活率及青石棉毒性检测细胞吞噬Trypan蓝实验显示，95% 以上的细胞可以吞噬Trypan蓝染料，提示细胞成活率较高;用不同剂量青石 棉刺激细胞24小时，发现100 p g/ml剂量无明显毒性反应。2.细胞内产生ROS的测定青石棉刺激BEAS一ZB细胞后，用DHE荧光探针与 细胞共孵育，细胞出现红亮染色，提示大量的ROS产生，使用SOD预处理 BEAS一ZB细胞，再以青石棉刺激细胞其红亮染色明显减退，显示SOD具有 阻断ROS的作用;用DCF荧光探针检测青石棉刺激细胞后的荧光光度，发 现刺激时间的延长ROS产生增加，但无明显差异，不同剂量的青石棉刺激细 胞后其ROS产生随剂量有所升高，但是大于250协g/ml的剂量Ros产生反 而下降，可能是细胞毒作用的原因。DHE显色结果提示青石棉产生的ROS 可能是以O:或OH一，而DCF染色提示Ros不可能是HZO:和OH一为主，因此青 石棉诱导的Ros应该主要是。一2。3.细胞因子IL一8的释放测定青石棉刺激BEAS一ZB细胞4h，收集其培养上清， ELIsA法测定IL一8含量，发现IL一8水平明显高于对照，差异有统计学意义 （P<0 .05）。4.Rl:PCR检测NRAMPZ mRNA表达青石棉作用于BEAS一ZB细胞后，两种 NRAMPZ异构体mRNA均有升高，但SOD可不同程度阻断NRAMPZ的表 达，以NRAMPZ一IRE为主。5.荧光化学定位实验FITC染色结果显示，青石棉和EGF作用于细胞后可激 活p一EGFR，显示该磷酸化蛋?