单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种非常典型的兼性胞内革兰氏阳性的食源性致病菌,是李斯特菌病的病原体。李斯特菌病的临床表现多样,这与Lm在人体内能够跨越三个紧密屏障的能力有关。食用受污染的食物后,Lm可越过肠屏障,侵入肠上皮,导致肠胃炎。此外,Lm还具有跨越孕妇胎盘屏障的独特能力,导致胎儿感染和败血性流产。最后,Lm能够穿过血脑屏障,感染脑膜,导致致命的脑膜炎和脑炎。在先天免疫细胞中,巨噬细胞在识别和清除病原体中发挥着重要作用。Kupffer细胞(KCs)是肝脏中的定居巨噬细胞,占机体所有组织巨噬细胞的80-90%。在正常生理情况下,肝脏中的巨噬细胞绝大部分都是KCs。但在李斯特菌感染过程中,肝脏中有两种主要的巨噬细胞亚群,分别是KCs和单核细胞来源的巨噬细胞。KCs是起源于胚胎时期的巨噬细胞,排列在肝窦周围,被认为是宿主抗肠道入侵细菌的关键因素。但是现有的研究结果显示Lm感染宿主后,KCs快速坏死,同时招募大量的单核细胞来源巨噬细胞并迁移至肝脏,从而快速控制感染,清除细菌。由于感染早期,KCs即大量死亡,暗示单核巨噬细胞在抗李斯特菌过程中发挥着重要作用,而非KCs。以往常使用氯磷酸盐脂质体来清除KCs研究其在抗病原体感染中的作用。但是氯磷酸盐脂质体特异性不高,其不仅能清除KCs,也能够清除血液中的单核细胞、单核巨噬细胞和其他组织器官中的定居巨噬细胞。因此,为了研究KCs在抗Lm感染中的作用,我们制备了Clec4f-Cre/DTR转基因小鼠。Clec4f基因特异性高表达在KCs中,而在血液单核细胞、单核巨噬细胞和其他组织器官的定居巨噬细胞中不表达。因此,给此小鼠腹腔注射DT(白喉毒素)能够实现对KCs的特异性清除。因为小鼠缺失Ccr2基因后,单核细胞不能从骨髓中迁出,导致血液单核细胞和单核巨噬细胞缺失,从而在病原体感染时不能被募集到肝脏中。因此,我们也应用Ccr2基因敲除小鼠验证单核巨噬细胞在抗Lm感染中的作用。为了研究上述内容,我们建立了Lm感染小鼠模型;利用Ccr2基因敲除小鼠验证单核巨噬细胞在抗Lm感染中的作用;构建了Clec4f-Cre/DTR转基因小鼠;利用Clec4f-Cre/DTR转基因小鼠证明了KCs在抗Lm感染中的作用。首先,我们通过死亡率、HE染色、流式细胞术、菌载量和ALT等的检测评价指标,成功建立了Lm感染小鼠模型。其次,通过流式细胞术检测在Lm感染前和感染后的不同时间点肝脏中两群巨噬细胞的数量和比例的变化,我们发现在感染后KCs的数量和比例呈现出一个先下降后上升并逐渐恢复到初始水平的过程;而单核巨噬细胞中呈现出一个先上升后下降的过程。最后,我们分别利用Ccr2基因敲除小鼠和Clec4f-Cre/DTR转基因小鼠研究单核巨噬细胞和KCs在抗Lm感染中的作用,通过流式细胞术、生存率检测和其肝脏细菌载量的情况证明了单核巨噬细胞和KCs在抗Lm感染过程中均发挥重要作用。综上所述,我们的研究结果显示本实验室构建的Clec4f-Cre/DTR转基因小鼠可以利用腹腔注射DT(白喉毒素)实现KCs的特异性清除。应用此转基因小鼠,我们证明在Lm感染的过程中,肝脏中KCs在抗李斯特菌中也发挥着重要作用。因此,本课题为后续进一步深入研究KCs在抗李斯特菌中的具体机制奠定了基础。