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海洋作为天然的宝库蕴藏着丰富的资源,近年来海洋生物资源的开发也成为了一大热点。研究发现海洋生物提取物具有抗癌、抗氧化、降血脂、免疫调节等功效。文蛤作为海洋四大养殖贝类之一,具有很高的食用性和药用价值。本实验室前期提取的氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp的文蛤寡肽(M.meretrix oligopeptides,MMO)在免疫调节方面的研究鲜有报道。因此,本研究以RAW264.7细胞为体外细胞模型、环磷酰胺(Cyclophosphamide,Cy)免疫抑制小鼠为体内动物模型,探讨MMO的免疫调节作用。体外实验设立空白对照组、阳性组(脂多糖,lipopolysaccharides,LPS)和MMO低、中、高剂量组,采用MTT比色法检测对RAW264.7巨噬细胞的活性,倒置显微镜、HE染色和透射电镜观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞周期变化,中性红吞噬实验检测细胞吞噬能力,免疫荧光标记法观察iNOS的表达情况,硝酸根还原酶法和ELISA法检测细胞培养上清液中NO、IL-6和IL-1β的含量,Western Blot法检测细胞中MAPKs信号通路相关蛋白表达情况,探讨MMO对RAW264.7细胞的免疫调节作用及潜在作用机制。体内动物实验设立正常组、模型组(Cy)、阳性药物组(左旋咪唑)和MMO低、中、高剂量组。腹腔注射给药及免疫抑制后,计算免疫器官指数;测量小鼠血清中IgG和溶血素含量;取脾脏、胸腺、肝脏进行HE染色;提取脾T淋巴细胞用Con A刺激,测量T淋巴细胞增殖转化能力;免疫组化法检测脾脏中NLRP3表达;Western Blot法检测小鼠脾脏中NF-κB信号通路相关蛋白表达情况,探究MMO对Cy免疫抑制小鼠的免疫调节作用及潜在作用机制。实验结果:1.MTT结果显示,MMO在10μg/mL至250μg/mL之间,对RAW264.7细胞的增殖作用呈剂量相关性。2.MMO高剂量组和LPS组,相比于空白对照组,在RAW264.7细胞周期中的G1/G0期细胞数占总细胞数百分比增加,S期减少,G2/M期增加。3.MMO药物组在光镜视野下RAW264.7细胞数量增加,细胞核内染色体有丝分裂加剧,电镜下细胞质内可见多个线粒体和噬菌体,细胞膜表面变形向外伸展形成伪足,向内凹陷形成吞噬小泡。中性红吞噬实验也显示MMO高剂量组吞噬指数升高。4.MMO药物组中iNOS表达量增加,RAW264.7细胞上清中NO、IL-6、IL-1β含量增加。5.MMO能缓解免疫抑制小鼠体重下降、脾脏和胸腺萎缩,增加脾脏指数和胸腺指数。血清中IgG、溶血素含量上升。6.HE染色结果显示:模型组小鼠脾脏中红髓和白髓界限混乱,胸腺中皮质和髓质无法区分,肝脏中肝索断裂,肝细胞受损。MMO药物组小鼠脾脏中脾小体结构恢复、白髓边缘区增加,胸腺T淋巴细胞、胸腺小体增加,肝脏中肝索恢复成放射状、肝细胞形态恢复近正常。7.免疫组化显示:MMO药物组小鼠脾脏中NLRP3表达减少。8.Western Blot显示:RAW264.7细胞中Erk、JNK蛋白磷酸化被激活,免疫抑制小鼠脾脏中IKKα、NF-κB p65蛋白磷酸化被抑制。实验结论:MMO的免疫调节作用包括:激活RAW264.7细胞的增殖与分化,磷酸化细胞内Erk、JNK蛋白,加速细胞周期中蛋白质的合成,刺激细胞膜表面形成伪足和吞噬小泡,增强RAW264.7细胞的吞噬能力,增加RAW264.7细胞合成iNOS,分泌NO、IL-6、IL-1β;减轻免疫抑制小鼠体重下降速度,缓解脾脏、胸腺、肝脏损伤,提升血清中IgG、溶血素的含量,减少NLRP3表达,抑制IKKα和NF-κB p65蛋白磷酸化,减轻Cy免疫抑制小鼠的免疫损伤和炎症反应,因此MMO具有开发成为安全型、高效型、经济型免疫调节剂的潜力。