目的:Foxl2(Forkhead box L2)是Forkhead转录因子家族的成员,最初在睑裂病/眼睑下垂/内眼角赘皮综合征(blepharophimosis/ptosis/epicanthus inversus syndrome,BPES)患者中被报道与克隆,随后的研究显示部分病人的卵巢发育障碍。为了阐明Foxl2基因的在卵巢发育中的功能,研究人员构建了小鼠等哺乳动物模型。青鳉是与人类性别决定方式相同、雄性异配型的低等脊椎动物,是生殖研究的重要模式动物。为了全面阐释Foxl2基因在性腺发育中的功能,本研究拟利用基因编辑技术,建立青鳉foxl2基因缺失的研究foxl2基因功能的新突变体材料,通过遗传传代获取foxl2基因杂合突变与纯合突变新材料,分别进行表型分析、组织学分析与相关基因表达分析,初步探究Foxl2基因缺失对青鳉性腺中的影响,为后续深入阐释Foxl2基因在性腺发育中的功能提供新的动物模型。方法:设计青鳉foxl2基因CRISPR靶位点,利用CRISPR/Cas9技术敲除青鳉foxl2基因建立foxl2基因缺失的新材料。通过PCR检测与测序选取造成foxl2基因移码突变或提前终止的突变类型作为亲本,再通过杂交选育的方式获取foxl2基因杂合突变与纯合突变新材料。比较分析野生型、杂合突变体与纯合突变新材料的表型特征、性腺等形态特征;通过组织切片结合染色技术比较分析性腺结构、生殖细胞与性腺体细胞的类型、分布与数量;再通过定量PCR等分子检测技术比较分析性腺发育相关基因的表达变化情况。结果:通过CRISPR/Cas9技术成功敲除了青鳉foxl2基因,选择缺失4个碱基与插入11个碱基的突变类型进行传代,建立青鳉foxl2基因缺失的突变体新材料。根据氨基酸预测这两种突变类型都会造成不能编码形成正常具有Forkhead结构域的FOXL2蛋白,即功能丧失。从第二性征与性腺表型上,foxl2基因缺失的纯合突变体表现为生理雄性,通过检测青鳉Y染色体标记DMY基因发现foxl2基因缺失纯合突变体(foxl2-/-)的遗传表型为XX型,进行组织切片分析发现XX型foxl2基因缺失纯合突变体的性腺从组织结构上不同于野生型的卵巢和野生型的精巢,其性腺中存在退化的核仁外周卵母细胞,在核仁外周卵母细胞和空腔周围没有观察到正常形态的粒层细胞;同时能观察到精子,初步提示foxl2基因缺失纯合突变体的性腺从组织结构上类似精巢。进一步定量PCR分析性腺分化与发育关键基因的表达情况,发现foxl2基因的缺失导致雄性性腺发育关键基因sox9b、gsdf、amh等的表达量升高,雌性性腺发育关键基因Cyp19a1a等的表达量下降,初步应证了foxl2基因缺失纯合突变体性腺雄性化的特征。结论:本研究以青鳉为研究对象,以Forkhead基因家族的foxl2基因的性腺功能为切入点开展研究,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功敲除foxl2基因,建立了foxl2基因缺失的新突变体材料。通过对比分析野生型雌性、野生型雄性、foxl2基因缺失杂合突变体(foxl2+/-)与foxl2基因缺失纯合突变体(foxl2-/-),表型特征、遗传表型、性腺组织学差异与性腺发育关键基因等,初步揭示了foxl2基因缺失的纯合突变体遗传雌性生理雄性的特征,发现了foxl2-/-突变体性腺中卵巢生殖细胞的退化与精巢生殖细胞的建立,定量PCR结果显示foxl2的缺失造成sox9b、gsdf、amh等基因的表达升高而cyp19a1a等基因的表达下降,从一定程度上应证了表型与组织学的分析。综上所述,foxl2基因的缺失会造成青鳉卵巢功能的退化乃至消失,证明了foxl2基因在卵巢发育中的功能从低等脊椎动物到哺乳动物包括人类中都非常保守,亟待深入研究。