目的：　　 自然流产是育龄妇女最常见的疾患之一。生育年龄的妇女，15～20％的临床妊娠以自然流产为结局；包括生化妊娠在内自然流产发生率可达30％～40％；约5％的育龄妇女会发生复发性流产。自然流产发生的危险性随着妊娠丢失次数的增加而增加，在连续2次胚胎丢失后，第三次胚胎丢失的危险性高达80％。　　 自然流产尤其是复发性流产病因复杂，遗传学异常、免疫因素是早期自然流产的主要原因，内分泌异常、解剖学异常、凝血功能异常、感染等亦被认为可导致自然流产，但即使经过严格的病因检查，仍然有40～60％的自然流产病因不明。探讨自然流产的发病成为医学和生物学倍受关注的研究方向之一。　　 RSA多数发生于妊娠的12周内，对于早期胚胎，在绒毛膜绒毛血管发生并建立有效胎盘循环之前，卵黄囊循环为胚胎发育提供稳定有效的营养、氧气支持。扩散至胚外体腔的营养物质及氧气依赖卵黄囊循环运送至胚胎体内，胚胎处于低氧状态，任何原因造成血氧供应不足，都可影响胚胎发育甚至导致胚胎丢失。胚胎血红蛋白作为胚胎期主要的携氧供氧载体，对胚胎的正常发育非常重要。　　 人类血红蛋白基因表达有着严格的时空特异性，在个体不同的发育阶段，基因簇上各个类α、β珠蛋白基因按其在染色体上自5'-3'的排列顺次表达。ζ和ε基因表达于胚胎早期，该基因几乎存在于所有哺乳动物基因中，提示此基因在物种进化淘汰中更具有生存优势；且ζ、ε基因表达时间与临床上自然流产高发时间段一致，推测该基因与自然流产发生具有高度相关性。这两个基因由于自身突变或在微环境干扰下表达异常或失衡，是否为自然流产发病机制的重要途径，是一个值得探讨的课题。本课题将通过对自然流产胚胎中ε、ζ基因进行突变及多态性筛查，以探讨该基因变异与自然流产的关系。　　 材料与方法：　　 1.样本收集：　　 2008年3月-2009年4月在中山大学医学院第一附属医院黄埔院区妇产科门诊人流室行人流清宫术的妇女，无菌收集其绒毛组织。其中，研究组40例，平均年龄28.2岁，自然受孕，平素月经周期规则，末次月经记忆准确，既往有或无类似病史，B超提示：胚胎停止发育，胚胎停育时孕周为6～8周；对照组35例，平均年龄27.5岁，自然受孕，平素月经周期规则，末次月经记忆准确，至少有一次成功妊娠史，B超证实宫内妊娠存活，孕周为6～8周，既往无自然流产史。　　 另外补充收集母体外周血标本。研究组收集2009年4月-2009年10月在中山大学干细胞中心研究所进行主动免疫治疗的妇女外周血50例，平均年龄27.8岁，有≥2次以上不明原因自然流产病史，平均流产次数为3.1次。对照组收集2009年4月-2009年10月在中山大学一院黄埔院区体检中心进行体检的妇女外周血50例，平均年龄28.3岁，既往至少有一次成功妊娠史，否认有自然流产史或死胎史。　　 无菌收集新鲜绒毛的胚胎组织约50-100mg，无菌生理盐水漂洗去除母体血污染，置于EP管内，-80℃保存；无菌收集外周血标本约2ml，置于EP管内，-80℃保存。　　 2.提取DNA：　　 根据AXYGEN DNA提取试剂盒说明按步骤提取DNA，紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度及浓度。　　 3.引物设计：　　 从UCSC Genome Bioinformatics数据库中提取ε基因、ζ基因相关序列作为标准序列。运用Primer Premier5软件，针对3个外显子及部分内含子、上游调控序列分片段设计引物。　　 4.PCR扩增目的片段：　　 取绒毛组织DNA2ul PCR扩增各个目的片段，反应程序按TaKaRa rTaq酶试剂盒程序说明书进行。取母体外周血DNA2ul扩增绒毛组织DNA筛选出的异常基因片段。　　 5.电泳：　　 每个PCR产物各取5ul加样至2％的琼脂糖凝胶样品槽孔中电泳。通过UVPTransilluminator凝胶扫描系统(M-26)成像，紫外灯下观察电泳胶板，经标准分子量(Marker)比较，判断PCR结果。　　 6.测序：　　 应用ABI公司的ABI Prism3100-Avant遗传分析仪对绒毛组织DNA PCR产物纯化测序。测序结果通过CLUSTALX软件与标准序列比对，确定突变位点及突变性质。　　 7统计分析：　　 所有数据均用SPSS12.0统计软件包进行统计分析，独立的两组二分类资料比较，采用卡方检验及Fisher确切概率法，P＜0.05认为差异有统计学意义；两变量关联性分析，采用卡方检验，P＜0.05认为相关性有统计学意义。　　 结果:　　 1、胚胎绒毛组织ε、ζ基因筛查共6个外显子片段未发现突变。　　 2、胚胎绒毛组织ε基因第一内含子84位点处发现插入4bpCAAA序列，该变异同时出现在研究组中及对照组中，两组基因型频率差异无统计学意义。　　 3、胚胎绒毛组织ζ基因第一内含子128位点处发现插入58bp序列，该变异同时出现于研究组中及对照组中，两组基因型频率差异有统计学意义，关联性分析提示该基因片段变异与自然流产相关。　　 4、胚胎绒毛组织ζ基因变异研究组中出现2例纯合子，对照组仅出现杂合子，纯合子基因型频率两组差异无统计学意义。　　 5、胚胎绒毛组织自然流产1次组与复发性流产组ζ基因变异基因型频率差异无统计学意义。　　 6、母体外周血ζ基因第一内含子58bp插入变异筛查，该变异同时出现在研究组及对照组，两组基因型频率比较差异有统计学意义，关联性分析提示该基因片段变异与自然流产相关。　　 7、母体外周血ζ基因第一内含子58bp插入变异研究组中出现2例纯合子，对照组仅出现杂合子，纯合子基因型频率两组差异无统计学意义。　　 结论:　　 1、ζ基因第一内含子存在一58bp插入序列，该基因多态性与自然流产相关。　　 2、ε基因内含子存在一4bp插入序列，该基因多态性与自然流产无相关性。　　 3、自然流产胚胎在本研究中未发现ε、ζ基因外显子突变。　　 4、母体外周血该ζ基因多态位点可否作为自然流产风险筛查指标之一，尚需大样本研究进一步确认。