本研究以不同品种枇杷为材料,首先进行胚性培养物诱导与继代保持、幼胚培养等离体培养研究,然后从胚性培养物中克隆乙烯合成的关键酶基因ACS和ACO,并进行农杆菌介导的ACO反义基因转化枇杷胚状体试验以及枇杷试管苗离体种质保存研究。主要研究结果如下:　　 1.枇杷胚性培养物的诱导与继代保持　　 以解放钟枇杷花药为材料,采用4因素3水平的L9(34)正交设计,研究了不同蔗糖浓度和植物生长调节剂浓度对枇杷花药愈伤组织诱导率的影响。附加30 g·L-1蔗糖、2.0mg·L-12,4-D和0.5 mg·L-16-BA的MS培养基较适合枇杷花药愈伤组织的诱导。试验并对本所沈庆斌硕士于2003从幼胚中诱导并筛选、已保存5年的胚性培养物进行了研究,采用MS+0.5mg·L-12,4-D+-0.25 mg-L-1KT和MS+0.5mg-L-12,4-D+0.25 mg.L-1 KR+5mg·L-1 AgNO3两种培养基交替继代,枇杷胚性培养物的可以长期继代保持。　　 2.枇杷幼胚培养与试管苗获得　　 本试验选取了4个产地不同的枇杷品种莆新本、森尾早生、长红3号和东湖早,分别对它们的幼胚萌发、试管苗增殖和生根进行了研究。幼胚大小和基因型的差异导致幼胚萌发率不同;不同光照强度或将子叶上半部分切除对幼胚萌发率影响不大,但前者会导致试管苗形态结构之间的差别;添加20g·L-1白糖的1/2MS培养基中枇杷幼胚的萌发率最高;不同MS浓度和白糖含量对4个枇杷品种幼胚萌发的影响规律是一致的,以莆新本枇杷为例,随MS浓度的降低,枇杷幼胚萌发率呈逐渐下降趋势,随白糖含量的升高,枇杷幼胚萌发率呈逐渐上升趋势。MS+1.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1或0.2 mg·L-1 NAA适宜作为不同品种枇杷试管苗的增殖培养基。1/2MS+0.4 mg-L-1 NAA较适合作为不同品种枇杷试管苗生根的培养基。　　 3.枇杷胚性培养物ACS基因的克隆　　 本试验首次以枇杷胚性培养物为材料,从其mRNA中克隆了ACS基因。采用同源克隆方法,首先得到两条大小同为523bp的ACS基因片段,再设计一对引物直接克隆枇杷ACS基因ORF。结果同时得到两条ACS基因,其大小均为1464bp,编码487个氨基酸;分别将其命名为EjACS-J和EjACS-2,两个ACS基因之间相似性为92％,1464中核苷酸中有115个碱基不同。对ACS基因编码的蛋白进行了生物信息学分析,两个蛋白理论等电点不同;总体表现为亲水性;EjACS-1蛋白不是一个跨膜蛋白:EjACS-2蛋白可能形成一个N末端在膜外、方向由外向内的跨膜螺旋;两个ACS蛋白均不含有信号肽,预测它们可能为非分泌蛋白。本试验从枇杷基因组DNA中也克隆到ACS基因,命名为gACS,大小为2319bp,与EjACS-2序列进行比较发现,ACS基因组中含有3个内含子,大小分别为89bp、106bp和660bp。　　 4.枇杷胚性培养物ACO基因的克隆　　 本试验从枇杷胚性培养物中克隆了ACO基因。采用同源克隆方法和3RACE技术得到枇杷ACO基因全长,将其命名为命名为EjACO-1。EjACO-1大小为1160bp,编码322个氨基酸。对ACO基因编码的蛋白进行了生物信息学分析。其理论等电点为5.35,属于酸性蛋白;整个多肽链表现为亲水性,可能是一个非跨膜蛋白和非分泌蛋白。从枇杷基因组DNA中克隆到ACO基因,命名为gACO,大小为1517bp;与EjACO-1序列进行比较发现,ACO基因组中含有3个内含子,大小分别为114bp、240bp和194bp。　　 5.ACS反义基因转化枇杷胚状体　　 本试验以农杆菌介导的遗传转化方法将ACS反义基因导入枇杷胚状体,采用正交设计对影响转化效率的因素进行了研究。通过统计GUS瞬时表达率,得到本试验因素的较优水平,分别为:侵染时间45min、共培养时间3d、重悬液中蔗糖浓度0 g·L-1、预培养时间12d、农杆菌重悬液OD6000.8,此时,枇杷胚状体GUS瞬时表达率最高。　　 6.枇杷试管苗离体种质保存研究　　 本试验首先对枇杷试管苗离体种质保存方法进行了探讨,研究了不同MS和多效唑浓度对枇杷试管苗离体保存的影响。1/3MS+4.0 mg·-1 PP333较适宜作为枇杷试管苗种质资源离体保存,当12个月不继代时,试管苗的存活率还能达到55.98％。4.0 mg·L-1的多效唑有利于枇杷试管苗的离体保存。以此培养基,对来源于不同地点的22份枇杷种质资源进行了离体保存,并对本所已保存2年的枇杷种质资源生长状况进行观察,并长期继代保持。