猪流行性腹泻病毒(PEDV)与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均属冠状病毒属,引起猪的高度接触性肠道传染病,给养殖业造成了重大经济损失,且目前没有有效的药物预防,疫苗是防控这两种病的最佳选择。本实验室前期已构建了携带TGEV S和PEDV S的双基因疫苗SL7207 (pVAXD-PS1-TS)和单基因疫苗SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS),并在小鼠模型上进行了SL7207 (pVAXD-PS1-TS)的免疫评价。为了进一步了解SL7207 (pVAXD-PS1-TS)在猪体的免疫原性与动态规律,我们将该双基因口服疫苗在猪体进行了免疫评价,对体液免疫、粘膜免疫、细胞因子、中和试验等进行了全面的评价,为科学评价该疫苗提供依据,为后续研究提供参考。将保存的疫苗菌株SL7207 (pVAXD-PS1-TS)、SL7207(pVAXD-PS1)、 SL7207(pVAXD-TS)复苏培养,抽提质粒对目的基因进行PCR和酶切鉴定,结果证实携带质粒的准确性,然后将菌株扩大培养制备口服疫苗。将15头仔猪随机分成5组,双基因免疫组SL7207 (pVAXD-PS1-TS)、单基因对照组SL7207(pVAXD-PS1)和L7207(pVAXD-TS)、空载体对照组SL7207(pVAXD)、含5%NaHCO3的PBS。将重组沙门氏菌以1.6×1011CFU的剂量分别口服接种3只仔猪,每头猪口服10mL,两周后以2.0×1011 CFU的免疫剂量加强免疫,免疫后无临床可见病变。分别在首次免疫后第0、2、4、6、8w采集仔猪血液和粪黏液样品,以ELISA检测血清IgG、γ-干扰素、IL-4、粪便黏膜IgA抗体的动态水平,以中和试验测定抗体中和效价,以MTT法检测外周血淋巴细胞增殖情况。体液免疫和黏膜免疫结果显示：免疫组SL7207 (pVAXD-PS1-TS)对照组SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)均可诱导机体产生特异性的血清IgG抗体及粪黏液IgA抗体,SL7207 (pVAXD-PS1-TS)能同时诱导针对TGEV和PEDV的特异性抗体。首免后第2w,免疫组SL7207 (pVAXD-PS1-TS)和对照组SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)特异性抗体开始增加,第4周均可检测到特异性IgG、IgA抗体；第6w抗体水平均达到最高峰,第8w抗体水平开始下降。中和实验结果显示,SL7207 (pVAXD-PS1-TS)、SL7207(pVAXD-PS1)、 SL7207(pVAXD-TS)均可诱导中和抗体产生,其中SL7207 (pVAXD-PS1-TS)组的PEDV中和效价10-1.57(1：37.17)略低于SL7207(pVAXD-PS1)中抗PEDV中和效价可达10-1.7 (1:50.25); SL7207(pVAXD-PS1-TS)中诱导的抗TGEV中和效价10-1.5(1：31.64)略低于SL7207(pVAXD-TS)诱导的抗TGEV中和抗体效价10-1.58(1：38.02)。细胞免疫结果显示：免疫组SL7207 (pVAXD-PS1-TS)对照组SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)仔猪血清中都能检测到IFN-y和IL-4。第6周达到最高峰,且SL7207(pVAXD-TS-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)、SL7207 (pVAXD-PS1)组诱导产生的IFN-y、IL-4含量与SL7207 (pVAXD)和PBS之间存在极显著差异(P<0.01)；SL7207 (pVAXD-PS1-TS)诱导产生的IFN-γ、 IL-4含量与SL7207 (pVAXD-PS1)相比,具有显著差异(P<0.05)。外周血T淋巴细胞的增殖结果显示：菌株SL7207 (pVAXD-PS1-TS)、SL7207(pVAXD-PS1)、 SL7207(pVAXD-TS)均可促进外周血T淋巴细胞的增殖。首免后第2w,外周血T淋巴细胞的增殖作用开始增强；第6w,外周血T淋巴细胞的增殖作用均达到最高峰,与对照组SL7207(pVAXD)、PBS间存在极显著差异(P<0.01)。且SL7207 (pVAXD-PS1-TS)的增殖作用大于SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)。因此,SL7207(pVAXD-PS1-TS)在增强宿主特异性细胞免疫方面比单基因疫苗更具优势。综上所述,口服疫苗SL7207(pVAXD-PS1-TS)在猪体具有良好的免疫原性,能够诱导全面的免疫反应包括体液、黏膜、细胞免疫。该疫苗的优势主要体现在它可以同时诱导针对TGEV和PEDV的免疫反应,而且SL7207 (pVAXD-PS1-TS)在增强宿主特异性细胞免疫方面比单基因疫苗更具优势。