研究背景及目的乳腺癌(Breast cancer, BC)是女性最常见的恶性肿瘤之一。按照文献统计,在全球范围内,每年有大约135万乳腺癌患者,其中有54万为新发病例,而每年因乳腺癌死亡的病例可达到50万。当前,乳腺癌治疗是以分子分型为指导,由手术、内分泌治疗、放化疗、分子靶向治疗和中医药治疗相结合的多学科综合治疗。乳腺癌的分子分型是根据雌／孕激素受体(ER/PR)、人表皮生长因子受体2(HER2)及增殖细胞核抗原Ki-67,乳腺癌可分为以下几种分型：管腔型,即luminal型,包括luminal A型和luminal B型；HER2过表达型和三阴型。随着诊疗方法的不断发展,乳腺癌的早期诊断率和治疗效果也在不断提高,已经成为目前预后比较好的实体肿瘤之一。但是在全球范围内乳腺癌的发病率仍呈逐年上升的趋势。在我国,女性中发病率第一的恶性肿瘤就是乳腺癌,且呈现出年轻化的趋势。由于乳腺癌的发生发展过程涉及到多种肿瘤相关分子的表达异常或功能改变,深入了解这些肿瘤相关分子的功能及其作用机制,才能进一步探索乳腺癌的发生发展机制和新的治疗靶点。研究已经证实,乳腺癌的分子病理进程涉及多种微小RNA (microRNAs, miRNAs)的异常表达。MicroRNAs (miRNAs)是一类长约18-24个核苷酸的内源性非编码小分子RNA。MiRNAs通过与靶基因mRNA3’非翻译区(3’ untranslated region,3’UTR)完全或不完全互补结合,降解靶基因mRNA或经转录后机制负向调控靶基因表达。MiRNAs几乎参与了所有与肿瘤发生发展相关的过程,包括肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移和血管生成、表观遗传学的变化及基因组稳定性的改变等。研究证实多种miRNAs通过调控靶基因参与乳腺癌的分子病理进程,根据所调控的靶基因在生物学功能上的差异,miRNAs在乳腺癌中可以充当抑癌基因或癌基因的角色。研究发现,miR-206、miR-34a、miR-200c、let-7、miR-335、miR-126、 miR-101、miR-125a/b和miR-145等在乳腺癌中担当抑癌基因的角色即tumor-suppressing miRNAs,而niR-21、miR-155、miR-10b、miR-27a和miR-221/222等则发挥着促进肿瘤发生发展的功能即onco-miRNAs。由此可见,进一步探索肿瘤特异性miRNAs及其靶基因的功能及作用机制,有助于明确乳腺癌的发生发展机制,为治疗和预后提供新思路。2001年于人Hela细胞中首次发现的miR-29家族,包括miR-29a、miR-29b和miR-29c三个成员,miR-29家族在多种肿瘤中担当着抑癌基因的角色,其中最重要的成员是miR-29b,又可分为miR-29b-1和miR-29b-2,虽然两种miR-29b分子来源不同,但序列完全相同,在不考虑空间构象的情况下对其进行研究不需要将两者区分开。在乳腺癌中对miR-29b的功能研究存在争议,有研究发现在乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7中miR-29b可以通过抑制靶基因的表达促进肿瘤细胞增殖、迁移和抗肿瘤细胞凋亡,与未出现腋窝淋巴结转移的患者相比,出现腋窝淋巴结转移的患者肿瘤组织中miR-29b显著上升。而另有研究发现GATA3可以通过诱导miR-29b表达影响其下游靶基因的表达,从而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移,在正常的乳腺上皮细胞中miR-29b呈高表达,miR-29b表达水平与组织分化程度和患者预后呈正相关关系。在HER2过表达型乳腺癌患者的肿瘤组织中,miR-29b的表达量较其他表型显著降低。考虑到乳腺癌不同分子表型的异质性和遗传背景的多样性,进一步对miR-29b在乳腺癌中的功能进行研究才尤为重要。HER2 (neu/c-erb-B2)基因是乳腺癌的主要致病相关基因,与肿瘤细胞恶性转化、增殖、转移等密切相关。在20-30%的乳腺癌患者中存在HER2基因扩增或产物过表达,HER2是乳腺癌患者预后的独立预测指标,与其他亚型相比,HER2过表达型乳腺癌患者的5年无病生存和总生存率最差。MiR-29b表达水平在HER2过表达型患者的肿瘤组织中显著降低,提示我们在HER2过表达型乳腺癌中miR-29b可能发挥着抑癌功能。我们运用靶基因预测软件对miR-29b的靶基因进行了预测,并没有在HER2mRNA 3’UTR区发现能与miR-29b种子区互补结合的序列,在筛选过程中我们关注到了与恶性肿瘤发生发展密切相关的细胞信号转导与转录激活因子(signal transducer and transaction factor 3, STAT3)。STAT3介导分子信号从细胞外向细胞核内的传递,生理情况下,STAT3的激活对细胞正常的生理功能发挥关键作用。但在多种恶性肿瘤中STAT3出现持续过度激活,是EGFR、Src及IL2/6-JAK等多个致癌性酪氨酸激酶信号通路的交叉点,过度激活的STAT3会上调其下游与细胞增殖(如cyclinDl/D2)、凋亡(如c-myc)、分化密切相关的基因的表达,促进细胞无限增殖、恶性转化和抗凋亡。STAT3过度激活也可以诱导与肿瘤细胞转移相关的基因如MMP、VEGF等的过表达促进肿瘤细胞的转移和血管生成,在多种肿瘤中STAT3的激活程度与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移情况及肿瘤细胞的耐药性等相关。在30%-60%原发性乳腺癌中存在STAT3过表达和持续激活,STAT3在乳腺癌中的过度激活与HER2过表达存在正相关关系,在HER2基因的启动子区存在可以与STAT3相结合的特定位点,STAT3可以促进HER2的表达,而过表达的HER2可以通过诱导IL-6的分泌与STAT3形成正反馈环路。研究也发现在HER2过表达型乳腺癌的干细胞化、上皮-间质转化和对Herceptin耐药的过程中STAT3均发挥着重要作用。在组织学检测中,我们发现乳腺癌患者肿瘤组织中miR-29b表达水平显著低于癌旁正常组织,在四种表型中,HER2过表达型患者肿瘤组织miR-29b表达水平最低,且HER2阳性是miR29b表达水平降低的独立危险因素。肿瘤组织中某种microRNA的表达缺失往往提示其担当抑癌基因的角色,结合目前乳腺癌中miR-29b的研究,基于组织学检测结果和对miR-29b靶基因预测筛选的情况,我们设想在HER2过表达型乳腺癌中,miR-29b可以通过负向调控STAT3发挥抑癌功能。目前尚无miR-29b在HER2过表达型乳腺癌中功能和作用机制的研究,因此在本研究中我们将关注miR-29b对HER2过表达型乳腺癌恶性生物学行为的影响,探索其发挥作用的机制,这可能为HER2过表达型乳腺癌患者的诊断和治疗提供新的思路和靶点。研究方法一. MiR-29b在乳腺癌组织中的表达及其临床意义1.乳腺癌组织、癌旁组织标本及临床病理资料的收集收集2012.11-2013.11南方医院手术切除的乳腺癌组织标本和癌旁组织标本67例,肿瘤组织经临床病理检查诊断均为原发性乳腺癌。配对的癌旁组织取自距离肿瘤组织边缘5cm。组织标本用10%福尔马林固定,石蜡包埋。患者在手术切除肿瘤前未接受过局部或者系统治疗。2.肿瘤组织与癌旁组织中MiR-29b的检测应用QIAGEN公司miRNeasy FFPE KIT提取石蜡组织标本中的总RNA,运用实时荧光定量PCR法检测miR-29b表达量。3.癌组织miR-29b表达水平的判定实时荧光定量PCR实验重复三次,采用相对定量法计算组织miR-29b表达水平：肿瘤组织(Cancer, C)和癌旁组织(Normal, N)各取平均Ct值,以U6 snRNA作为内参,计算两组的2-ΔΔCt值；以U6 snRNA和癌旁组织作为对照,计算肿瘤组织相对与癌旁组织的相对表达量(C/N),数据经log10转换,当<0时定义为表达下降；当≥0定义为表达升高。二、上调miR-29b表达对HER2过表达型乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响细胞株检测中发现HER2过表达型乳腺癌细胞株MDA-MB-435和SK-BR-3中miR-29b的表达水平较正常乳腺上皮细胞和其他表型乳腺癌细胞均显著降低,选择这两株细胞进行下一步的细胞学实验。1.细胞株的培养条件人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞选用McCoy’ 5a培养基+10%胎牛血清+1%双抗,MDA-MB-435选用DMEM培养基(高糖)+胎牛血清10%+1%的双抗,置于37℃,5% CO2,95%湿度培养箱中培养。2. MiR-29b mimics转染MDA-MB-435及SK-BR-3细胞使用Lipofectamine2000转染乳腺癌细胞株,miR-29b mimics的最终转染浓度为50nm,转染后通过荧光定量PCR法检测是否过表达成功。3.上调miR-29b表达对MDA-MB-435及SK-BR-3细胞增殖及侵袭的影响转染miR-29b mimics之后,经CCK-8实验、Transwell细胞侵袭实验、流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡及裸鼠皮下移植瘤实验,观察miR-29b在体内外对HER2过表达型乳腺癌增殖、细胞周期和凋亡及侵袭能力的影响。三、MiR-29b下游靶基因的预测和确定及其对STAT3调控作用的研究1.构建野生型STAT3 3’UTR (STAT3_WT)和突变型STAT3 3’UTR (STAT3_MUT)质粒。2.双荧光素酶活性检测：miR-29b mimics/scramble与质粒共转染两株乳腺癌细胞,48小时后检测双荧光素酶活性变化。3.通过荧光定量PCR法检测MDA-MB-435和SK-BR-3细胞转染MiR-29b mimics/scramble后STAT3 mRNA的变化。4.使用Western-blot法检测转染miR-29b mimics后,MDA-MB-435和SK-BR-3细胞内STAT3蛋白表达量的变化。四、STAT3参与miR-29b介导的对HER2过表达型乳腺癌细胞生物学特性的影响1.细胞株的培养条件SK-BR-3和MDA-MB-435培养条件同前所述。2. si-STAT3/control转染MDA-MB-435及SK-BR-3细胞使用Lipofectamine2000转染乳腺癌细胞株,转染后通过荧光定量PCR检测STAT3 mRNA、Western-blot法检测STAT3蛋白水平,验证siRNA是否成功敲低STAT3。3.下调STAT3表达对HER2过表达型乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响转染si-STAT3/control之后,经CCK-8实验、Transwell细胞侵袭实验、流式细胞术细胞周期及细胞凋亡实验,观察两不同处理组乳腺癌细胞增殖、侵袭、细胞周期和凋亡的变化情况。4. Rescue实验(靶标蛋白回复实验)进一步证实HER2过表达型乳腺癌中miR-29b对STAT3的直接调控作用五、MiR-29b对STAT3及其下游信号分子表达的影响Western-blot法分别检测转染si-STAT3/control和miR-29b mimic/scramble的两株细胞中STAT3及其下游信号分子的蛋白表达情况。免疫组化检测两个不同处理组(miR-29b mimic/scramble转染组)裸鼠瘤块中STAT3与HER2的表达情况。结果一、MiR-29b在乳腺癌中的表达及临床意义1.肿瘤组织miR-29b平均2-ΔΔCt值为1.338±0.776,癌旁正常组织平均2-ΔΔct值为3.528±1.980。配对t检验结果显示：差值(肿瘤组织miR-29b-癌旁正常组织miR-29b)为-2.190±2.224 (95%CI:-2.733～-1.648), miR-29b在乳腺癌肿瘤组织与癌旁正常组织中表达水平的差异具有统计学意义(t=-8.060,P<0.001),肿瘤组织中miR-29b表达水平显著降低。2. 以内参U6 snRNA和癌旁组织为对照,计算肿瘤组织(Cancer, C)相对正常组织(Normal, N) miR-29b表达水平的相对变化(C/N),67例乳腺癌患者中,50例(74.63%)患者肿瘤组织miR-29b表达量较癌旁正常组织降低。3.单因素分析显示：①在不同年龄、组织病理学类型、淋巴结转移情况、ER/PR状态中,miR-29b的表达无统计学差异(P值均>0.05)；②肿瘤最大径>5cm的乳腺癌患者miR-29b表达量显著低于肿瘤最大径<5cm的患者(P<0.001)；③HER2阳性乳腺癌患者miR-29b表达量显著低于HER2阴性的患者(P=0.002)。4.非条件logistic回归分析显示：肿瘤最大径>5cm和HER2阳性表达是乳腺癌患者miR-29b表达水平降低的独立危险因素(P=0.003; P=0.005), miR-29b表达水平降低的危险性分别是肿瘤最大径<5cm和HER2阴性表达的患者的27.617倍和11.284倍。5.四种不同分子分型的乳腺癌患者中,HER2过表达型患者肿瘤组织miR-29b表达水平最低。二、上调miR-29b表达对HER2过表达型乳腺癌增殖和侵袭的影响1.与正常乳腺细胞Hs578Bst及其他分子表型的乳腺癌细胞相比,HER2过表达型乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-435的miR-29b表达水平均显著降低(P值均<0.05),HER2过表达型乳腺癌组织和细胞中miR-29b的表达显著下调提示其可能担当抑癌基因的角色。我们选择SK-BR-3和MDA-MB-435进行细胞学实验。2.荧光PCR法检测转染miR-29b mimic后SK-BR-3和MDA-MB-435细胞中miR-29b的表达,结果显示mimic转染组细胞miR-29b表达分别较scramble对照组升高了约456倍(t=-18.546,P<0.001)和187倍(t=-11.639,P<0.001),瞬时转染miR-29b mimic可以显著上调两株细胞内miR-29b的表达水平,满足下一步实验要求。3.CCK-8法检测SK-BR-3与MDA-MB-435细胞转染miR-29b mimic后细胞体外增殖能力的变化,实验结果显示：在转染后的48小时和72小时,mimic转染组细胞增殖能力显著低于scramble对照组细胞(P值均<0.05)。4. Transwell细胞侵袭实验结果：mimic转染组的穿膜细胞数显著低于scramble对照组细胞(t=-4.026, P-0.016; t=-5.567, P=0.005)。5.流式细胞术细胞周期检测的结果：与scramble对照组相比, mimic转染组SK-BR-3与MDA-MB-435细胞G1期比例显著增加(t=-4.818,P=0.009；t=-2.809,P=0.048),S期比例显著降低(t=4.659, P=0.010; t=3.866, P=0.018), mimic转染组的细胞G1→S期转换受阻。6.流式细胞术细胞凋亡检测的结果：与scramble对照组相比,SK-BR-3与MDA-MB-435细胞的凋亡细胞数显著增多(t=4.786,P=0.009;t=5.301,P=0.006)。7.裸鼠皮下移植瘤实验结果：mimic瘤内注射可以显著上调miR-29b的表达水平(t=-2.512,P=0.046),从第13d测量开始mimic转染组裸鼠皮下肿瘤体积显著小于scramble对照组(P值均<0.01),处死裸鼠后发现mimic转染组瘤块重量较对照组显著减轻(t--6.769,P=0.001)。三、MiR-29b下游靶基因的预测和确定及其对靶基因STAT3的调控作用1.构建野生型STAT3 3’UTR (STAT3_WT)和突变型STAT3 3’UTR (STAT3_MUT)质粒。2. MiR-29b mimic/scramble与载体共转染SK-BR-3与MDA-MB-435细胞,48h检测双荧光素酶活性,结果显示：miR-29b mimic与野生型STAT3 3’UTR (STAT3_WT)质粒共转染,可显著降低STAT3 3’UTR区荧光酶活性(t=8.807,P=0.001;t=4.619,P=0.010),而miR-29b mimic与突变型STAT3 3’UTR (STAT3_MUT)质粒共转染则无此作用。3.荧光定量PCR法检测转染miR-29b mimic后SK-BR-3与MDA-MB-435细胞中STAT3 mRNA表达量的变化,结果显示：转染miRNA-29b mimic后,与对照组相比,两株细胞中STAT3 mRNA的表达量显著降低(t=4.062,P=0.015；t=4.585,P=0.010)。4. Western-blot结果显示：与对照组相比,转染miR-29b mimic之后SK-BR-3与MDA-MB-435细胞中STAT3蛋白量显著降低(t=-64.640,P<0.001；t=--73.323,P<0.001)。四、STAT3参与miR-29b介导的对HER2过表达型乳腺癌细胞生物学特性的影响1.荧光PCR和Western-blot检测转染si-STAT3/control后SK-BR-3与MDA-MB-435细胞中STAT3的表达,结果显示转染组较对照组STAT3 mRNA的表达量显著下降(t=9.412, P=0.001; t=8.630, P=0.001), STAT3蛋白表达水平显著降低(t=-828.395, P< 0.001; t=-144.738, P< 0.001),说明si-STAT3转染后可以显著下调STAT3的表达,满足下一步的实验需求。2.CCK-8法检测不同处理组SK-BR-3与MDA-MB-435细胞转染后细胞体外增殖能力的变化,实验结果显示：在48小时和72小时,si-STAT3转染组细胞增殖能力显著低于对照组(P值均<0.01)。3. Transwell侵袭实验检测SK-BR-3与MDA-MB-435细胞转染si-STAT3后细胞侵袭能力的变化,实验结果显示：si-STAT3转染组的穿膜细胞数显著低于对照组(t=3.558, P=0.024; t=4.852, P=0.008)。4.流式细胞术细胞周期检测的结果显示：与对照组相比,SK-BR-3与MDA-MB-435细胞G1期比例显著增加(t=-4.904, P=0.008; t=-3.729,P=0.020),S期比例显著降低(t=5.350, P=0.006; t=4.119, P=0.015),转染si-STAT3后细胞周期G1→S期转换受阻。5.流式细胞术细胞凋亡检测的结果显示：与对照组相比,si-STAT3转染组SK-BR-3与MDA-MB-435细胞的早期凋亡率显著升高(t=-5.538,P=0.005；t=-3.258,P=0.031)。6. Rescue实验结果显示：共转染miR-29b mimic和pcDNA3.1,靶基因的蛋白表达水平最低,细胞生长速度最慢,细胞侵袭数量最低；共转染pcDNA-STAT3和scramble,靶基因的蛋白表达水平最高,细胞生长速度最快,细胞侵袭数量最高；更重要的是,共转染pcDNA-STAT3+miR-29b mimic和pcDNA3.1+scramble,靶基因的蛋白表达水平,细胞生长速度和细胞侵袭数量均居于前两者之间。五. MiR-29b对STAT3及其下游信号分子表达的影响Western-blot结果显示：过表达miR-29b与敲低STAT3表达都可以显著降低STAT3、p-STAT3及MMP-2、CCND2及HER2蛋白表达水平(P值均<0.05)。免疫组化法检测mimic转染组及scramble转染组裸鼠瘤块内的STAT3及HER2表达水平,发现与scramble转染组相比,miR-29b mimic转染组的STAT3与HER2表达显著降低,STAT3与HER2呈同向变化。结论一. 与癌旁正常组织相比,miR-29b在乳腺癌患者肿瘤组织中的表达水平显著下降,其表达水平与肿瘤大小、HER2的表达状态相关,肿瘤最大径≥5cm、HER2阳性是乳腺癌患者miR-29b表达量降低的独立危险因素；所有分子分型中,miR-29b在HER2过表达型患者中的表达水平最低,提示miR-29b在乳腺癌尤其是HER2过表达型乳腺癌中可能发挥抑癌功能。二. 与正常乳腺细胞和其他分子分型乳腺癌细胞相比,MiR-29b在HER2过表达型乳腺癌细胞SK-BR-3及MDA-MB-435中的表达水平显著降低,与组织学检测结果一致,过表达miR-29b在体内外均能抑制HER2过表达型乳腺癌细胞的生长。三. HER2过表达型乳腺癌中,STAT3是miR-29b的靶基因,miR-29b能与STAT3 mRNA 3’UTR区互补结合,在mRNA和蛋白两个水平负向调控STAT3表达。四. 敲低STAT3和过表达miR-29b取得的生物学效应一致,均可以抑制HER2过表达型乳腺癌的生长,在过表达miR-29b的细胞内恢复STAT3的表达可以部分逆转miR-29b的抑癌功能,说明在HER2过表达型乳腺癌中,miR-29b是直接调控STAT3发挥抑癌功能的。五. miR-29b通过靶向调控STAT3影响其下游信号分子MMP-2、CCND2及HER2的表达,发挥抑制HER2过表达型乳腺癌恶性生物学行为的功能。