研究背景内膜损伤是动脉粥样硬化(Atherosclerosis, As)的始发环节。研究表明oxLDL引起平滑肌细胞凋亡,可能与上调P53和下调Bcl-2的表达有关。另一些研究已证实oxLDL与细胞膜表面的受体LOX-1结合引起内皮细胞的凋亡,主要经下调Bcl-2的蛋白表达,线粒体依赖性凋亡信号通路。PCSK9作为一种神经细胞凋亡调节转化酶,参与肝脏的再生,调节神经细胞的凋亡,脂质代谢等多种作用。通过降低肝细胞上LDLR的数量,影响LDL的内化,使血液中LDL不能清除,从而导致高胆固醇血症。高胆固醇血症是一个已被确认的动脉粥样硬化的独立危险因素。另有研究证实PCSK9在胚胎发育中具有促进神经细胞分化的作用,体外细胞实验发现其可参与神经细胞的凋亡,在此过程中有凋亡调节因子Caspase3和死亡受体6的共同调节。本课题组的前期研究表明:PCSK9 siRNA能明显抑制oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的凋亡,但其机制不清。PCSK9 siRNA是否对血管内皮细胞的凋亡也有影响还未见报道。目的本研究为了检测oxLDL诱导的HUVECs凋亡中PCSK9的表达变化;PCSK9 siRNA是否抑制oxLDL诱导的HUVECs凋亡及探讨其机制。材料与方法用不同浓度的oxLDL处理HUVECs 24h,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,RT-PCR、western blot分别检测PCSK9 mRNA、LOX-1 mRNA和NARC-1、LOX-1蛋白的表达。应用Lipofectamine2000转染不同浓度的PCSK9 siRNA进入HUVECs,筛选出最有效的siRNA浓度转染HUVECs 24 h后,再加入oxLDL处理24 h,Hoechst33258染色观察评价细胞凋亡,western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax及Caspase3,-8,-9的表达,酶标法检测Caspase3和Caspase9的活性,Hoechst33258染色观察形态评价细胞凋亡和流式细胞计数凋亡率。结果随着oxLDL浓度的不断增加,HUVECs凋亡率逐渐增加,以80μg/ml oxLDL处理24h后,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞。同时RT-PCR、western blot检测发现LOX-1和NARC-1mRNA,蛋白表达均增高。不同浓度的PCSK9 siRNA转染HUVECs后,RT-PCR和western blot筛选出siRNA终浓度,作用细胞24 h后,再用oxLDL处理24 h,Hoechst33258染色和流式细胞术检测oxLDL处理组细胞凋亡率明显增加,转染PCSK9 siRNA组细胞凋亡率明显减少。而RT-PCR和western blot检测结果表明LOX-1的蛋白和mRNA表达在转染PCSK9 siRNA组和oxLDL组无明显差异。Western blot检测结果发现PCSK9 siRNA能明显下调Bax蛋白的表达和上调Bcl-2蛋白的表达,同时观察转染80nmol/L PCSK9 siRNA后用oxLDL处理细胞24小时其对Caspase3,Caspase8和Caspase9的影响,western blot结果显示Caspase3,Caspase9的蛋白表达明显上调,而对Caspase8的蛋白表达无影响。酶标法检测Caspase3,Caspase9的活性均降低。结论1.OxLDL能上调PCSK9 mRNA和蛋白质的表达,而PCSK9 siRNA能有效抑制PCSK9基因的表达,从而抑制由oxLDL诱导的HUVECs凋亡。2.PCSK9 siRNA抑制HUVECs的凋亡主要经Bcl/Bax-Cyt C-Caspase 9-Caspase3线粒体凋亡通路。