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目的:子宫内膜异位症（Endometriosis,EMs,内异症）是妇科高发疑难病,综合发病率约为10%,持续困扰着全球约1.9亿育龄期女性,主要引起患者不孕、痛经、慢性盆腔痛等,同时子宫内膜异位症恶变（Malignant transformation of endometriosis,内异症恶变）问题越来越受到关注。流行病学研究显示子宫内膜异位症恶变率高达1%,恶变风险与患者病程、年龄等因素呈正相关。内异症恶变部位主要在卵巢,卵巢部位的子宫内膜异位症直接恶变的风险大约每8年增加0.7-1.6%。当前子宫内膜异位症恶变机制尚不明确以及缺乏特征性临床症状和非侵入性检测方法,因此亟待发现子宫内膜异位症恶变早期诊断的特异性分子生物标志物。子宫内膜异位症恶变课题一直是妇科研究的热点领域,同时由于长期缺乏良好的细胞模型和疾病模型使其也是研究开展的难点领域。为了更贴近内异症疾病状态,目前普遍采取的折中方法是利用子宫内膜组织中提取原代内膜细胞体外培养,而原代内膜细胞未永生化前培养时间和传代次数有限,同时存在一定的个体差异和提取操作误差,使得原代细胞数量不足难以满足细胞实验的铺开。长期以来的外科子宫内膜异位症小鼠模型,只适用于短期（1-2个月）喂养,而异位病灶存活时间较短难以观察到典型的恶变趋势,阻碍了内异症恶变造模研究。综上,子宫内膜异位症恶变研究相对严重滞后,内异症恶变分子机制研究更是十分匮乏。目前已有较多研究证实内异症具有较高风险发生恶变,而内异症多发病在年轻女性,为其恶性转化提供了一个很长的窗口期,因此需要我们对内异症恶变相关机制深入研究以期识别可能出现的早期恶变,从而达到早期发现和早期干预的目的。人类基因中大约只有不到2%的序列参与蛋白编码,即使已转录的RNA分子也只有10%左右最终直接参与蛋白合成,其余90%不能翻译成蛋白的RNA分子统称为非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）,包括长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）、微小RNA（micro RNA,miRNA）和环状RNA（circular RNA,circ RNA）等。通过对内异症相关卵巢癌、非内异症相关卵巢癌、卵巢异位内膜和良性卵巢组织检测后发现内异症相关卵巢癌分子类型更接近于子宫内膜来源的恶性肿瘤,同时内异症相关卵巢癌在病理类型、致病因素、分子学特征等方面与Ⅰ型子宫内膜癌存在诸多相似性。近年来,许多研究报道lnc RNA参与细胞生物学的各个方面,可能通过刺激或抑制细胞增殖、凋亡、分化、侵袭和转移等促进肿瘤的发生发展。由于子宫内膜异位症恶变新鲜组织难以短周期内集中获取,课题组前期通过对Ⅰ型子宫内膜癌组织进行lnc RNA/mRNA芯片筛查,发现lnc RNA BANCR和CPNE3 mRNA是其中表达明显上调的一组,且存在显著相关性。通过生物信息学分析发现lnc RNA BANCR、CPNE3与miRNA-612存在相同的结合位点,因此推测:lnc RNA BANCR通过竞争性结合miRNA-612上调CPNE3的表达促进了子宫内膜异位症恶变。本研究将通过组织、细胞、在体水平证明LncRNA BANCR/miRNA-612/CPNE3调控轴通过促进增殖、迁移在内异症恶变过程中发挥促进作用,LncRNA BANCR可能是内异症恶变新的分子靶标。本课题研究思路和方法或可为内异症恶变研究领域注入新的活力。研究方法:第一部分:利用Arraystar Human LncRNA/mRNA组织芯片检测3对Ⅰ型内膜癌癌组织及其对照组织,建立分子表达谱筛选目标分子结合生信数据库分析和预实验结果提出的科学设计。收集了12对卵巢内异症恶变组织及其在位内膜对照组织,qRT-PCR和Western blot分别检测验证了LncRNA BANCR、miRNA-612及CPNE3分子在各组织中的表达量和相关关系。第二部分:Fish实验证实LncRNA BANCR在细胞内的表达定位,利用双荧光素酶实验以验明LncRNA BANCR/miRNA-612/CPNE3三者相互结合调控的可能性。利用质粒转染技术在内异症在位内膜基质细胞（Eutopic endometrial stromal cells,EESCs）、正常子宫内膜基质细胞（Normal endometrial stromal cells,NESCs）进行BANCR、miRNA-162和CPNE3分子调控,利用CCK8、划痕、Transwell实验验证各基因对细胞生物学行为的影响。利用NESCs转染后在裸鼠皮下注射,证实BANCR、miRNA-162和CPNE3基因对原代子宫内膜细胞皮下存活能力的影响;再通过构建稳转的基因调控Ishikawa细胞在裸鼠皮下成瘤,通过瘤体测量绘制生长曲线,免疫组化检测各荷瘤组织中CPNE3蛋白的表达,探索BANCR、miRNA-162和CPNE3基因异常表达在体水平对于皮下瘤体生长的影响。结果:第一部分:通过芯片筛查,我们共发现2283个上调和5801个下调的LncRNA,同时有5557个上调的和2374个下调的mRNA。其中LncRNA BANCR、CPNE3是表达量增高且具有显著相关性的一对基因。生物信息学GEO数据库相关数据集的分析结果验证了LncRNA BANCR、CPNE3在子宫内膜癌中高表达,同时继续在其他数据集挖掘下发现CPNE3在内异症在位内膜中表达量显著高于正常内膜。然后对内异症恶变组织的检测我们验证了LncRNA BANCR、CPNE3在癌组织中表达量增高且表达量显著正相关,免疫组化结果也显示CPNE3蛋白表达内异症恶变癌组织＞内异症恶变在位内膜;内异症在位内膜＞正常子宫内膜。第二部分:Fish实验结果证实LncRNA BANCR主要定位于胞浆。海肾-萤火虫双荧光素酶实验证实野生型LncRNA BANCR或CPNE3与miRNA-612共转染至293T细胞荧光值更低,而突变型LncRNA BANCR或CPNE3与miRNA-612共转染293T细胞后荧光数值较NC组无明显变化。转染LncRNA BANCR或CPNE3过表达质粒后的NESCs细胞,CCK8细胞活性检测较NC组增强、划痕实验同等时间后愈合面积更大、Transwell穿膜细胞更多,同时CPNE3蛋白和mRNA表达也随之增高。对NESCs细胞共转染BANCR或CPNE3过表达质粒及miRNA-612 mimics后发现,较单一转染过表达的BANCR或CPNE3组细胞增殖、迁移能力减弱,出现细胞功能的回复,且CPNE3蛋白及mRNA水平也降低。而转染LncRNA BANCR或CPNE3敲降质粒的EESCs细胞增殖能力减弱、划痕实验较NC组愈合面积更小、Transwell穿膜细胞更少,且CPNE3蛋白和mRNA表达降低。对EESCs细胞共转染BANCR或CPNE3敲降质粒及miRNA-inhibitor后,较单转BANCR或CPNE3敲降质粒的细胞亦出现功能的回复,且CPNE3蛋白和mRNA水平回升。过表达了BANCR或CPNE3的NESCs细胞组较NC组皮下存活增多,组化实验CPNE3蛋白表达增高。而共转染BANCR+miRNA-612 mimics组和CPNE3+miRNA-612 mimics组较单一过表组细胞存活率降低,CPNE3蛋白表达减少。Ishikawa细胞稳转后裸鼠皮下荷瘤,BANCR或CPNE3过表达组瘤体较NC组生长速度快,最终荷瘤体积更大且CPNE3蛋白表达增高,共转染BANCR+miRNA-612 mimics组和CPNE3+miRNA-612 mimics组较单一过表达组瘤体生长速度减缓及最终荷瘤体积减小,组化实验证实瘤体的CPNE3蛋白表达减少。结论:1.LncRNA BANCR和CPNE3基因为Ⅰ型子宫内膜癌芯片筛查和数据库验证结果中高表达的候选分子;生信分析结果获知,miRNA-612分别与两个分子有互作关系,可能互为具有调控作用的分子。2.对内异症恶变组织中的验证,LncRNA BANCR表达上调、miRNA-612表达下调、CPNE3基因表达上调,且LncRNA BANCR与CPNE3表达呈正相关,miRNA-612与CPNE3表达呈负相关。同时,内异症恶变组在位内膜、内异症组在位内膜及正常内膜比较,三个分子具有同样梯度表达水平特征,为后续研究提供良好证据基础。3.LncRNA BANCR可以与miR-612竞争性结合,继而降低了对CPNE3基因表达的抑制作用,促进细胞增殖、迁移能力。4.LncRNA BANCR、CPNE3基因异常表达对子宫内膜细胞皮下异位存活能力和种植瘤生长具有促进作用,而miRNA-612异常表达则起抑制作用,与细胞水平分子调控作用相似。