目的和意义许多研究证实了肿瘤组织中并不是每个肿瘤细胞都具有致瘤性,而是由一部分比例极低的细胞所决定,这部分细胞被称为肿瘤干细胞,并且认为肿瘤干细胞是导致肿瘤发生的“根源”。肿瘤干细胞一个主要特征是具备自我更新能力,它一方面自身分裂一个或两个与母代特性相同的子代细胞,另一方面发生分化产生终末分化肿瘤细胞,这种分裂和分化导致了肿瘤细胞快速扩增。此外,肿瘤干细胞还具有成瘤性以及对化疗放疗的抵抗作用。由于肿瘤干细胞对化疗放疗作用不敏感,导致传统的治疗方式只能杀死终末分化肿瘤细胞,而对肿瘤干细胞作用不明显。治疗后残存的肿瘤干细胞通过不断扩增而导致了肿瘤复发。针对肿瘤干细胞自我更新、成瘤以及药物抵抗性等特征的治疗方法将有利于“杀灭”肿瘤干细胞,从而根除肿瘤。许多研究已发现在不同器官组织肿瘤干细胞中存在一些特殊功能的基因,这些基因表达或缺失可以调节肿瘤干细胞自我更新能力、放疗和化疗药物敏感性以及在免疫缺陷的小鼠体内成瘤能力。例如增加Let-7在乳腺肿瘤干细胞中的表达,可以降低其分子靶点H-Ras和HMGA2表达,从而可以降低乳腺肿瘤干细胞自我更新能力,并阻滞其成瘤能力,同时也增强了对化疗药物治疗效果。ABCG2是多重耐药基因家族的一种,它在多种肿瘤干细胞中高表达,并且调节其表达可以改变肿瘤干细胞对治疗药物的敏感性。总的而言,这些研究结果提示了联合放疗和化疗药物并针对肿瘤干细胞中特殊基因的分子靶向治疗将是根除肿瘤的一个有效手段在众多与肿瘤发生相关的基因中,CD24突显出越来越重要的地位。CD24是一种粘蛋白样结构的膜表面分子,由31个氨基酸组成,包含了16个N-和O-连接的糖基化位点。在正常生理条件下,CD24的瞬时表达促进了血液细胞选择性成熟和分化倾向。在胚胎胰腺组织发育过程中,CD24也起到了重要作用。有报道证实,沉默CD24表达可以抑制淋巴前体细胞向B或T细胞发育,从而导致了系统免疫缺失,这说明了CD24在体内胚胎或多种器官成熟过程中发挥了重要作用。近年来,许多研究表明CD24在多种肿瘤与癌前病变组织中高表达,并且与肿瘤的发生发展及预后有着密切联系。我们前期研究结果也表明CD24通过激活MAPK信号途径而促进结肠肿瘤增殖。在脑胶质瘤中,CD24表达缺失促使了肿瘤细胞分化而抑制了肿瘤生长发育,增加了对药物的敏感性。在乳腺癌和胰腺癌中,CD24能维持肿瘤干细胞自我更新和分化潜能的特性。此外,在结肠癌中,CD24表达主要集中在肿瘤干细胞CD133+细胞亚群,在CD133-细胞亚群中表达很少或无表达。然而,CD24对结肠肿瘤干细胞的调控作用及机制目前还不清楚。本研究采用功能缺失和功能获得性实验,从体外、体外以及mRNA和蛋白水平,探讨了CD24对结肠肿瘤干细胞自我更新,化疗药物抵抗,细胞分化能力以及成瘤能力的调节作用。研究结果不仅可以丰富了结肠肿瘤干细胞理论,更重要是为以肿瘤干细胞为靶标的结肠肿瘤治疗提供了新的思路。方法与结果1.建立稳定表达CD24蛋白的细胞克隆转染CD24重组过表达质粒pcDNA3.1(+)-CD24进入HCT116细胞株并采用1200ug／ml G418进行筛选,建立了CD24表达升高的细胞克隆,并命名为HCT116CD24和空质粒对照细胞克降HCT116vector。采用荧光定量PCR和流式细胞术检测CD24在HCT116CD24和HCT116vector细胞克隆中的表达,结果发现,CD24mRNA水平在HCT116CD24细胞克隆中明显高于HCT116vector(p<0.001),流式细胞术分析结果也提示CD24蛋白表达水平在HCT116CD24细胞克隆中明显升高(p<0.001)。2.在结肠肿瘤细胞中上调CD24的表达可以增加CD133表达,同时不影响肿瘤细胞上皮属性采用流式细胞术分析HCT116CD24细胞克隆和HCT116vector细胞克隆中CD133表达和Epcam表达的表达情况,结果证实：与对照组相比,在HCT116CD24细胞克隆中,CD133表达升高了近20倍(p<0.001),而Epcam在两者的表达没有明显差异(p=0.531)。提示CD24表达上调可以增强CD133表达,对Epcam表达无影响,即没有改变结肠肿瘤细胞的上皮属性。3.上调CD24表达增强了结肠肿瘤细胞对5-FU和奥沙利铂的抵抗性为探讨CD24表达上调对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响,我们分别选择不同药物浓度的5-FU (0,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,250μg/ml,500μg/ml)或奥沙利铂(0,5μM, 10μM,20μM,50μM,100μM)作用于HCT116CD24细胞克隆和HCT116vector细胞克隆,采用CCK-8检测细胞活性。结果表明：在5-FU处理后的HCT116CD24细胞克隆中细胞活性明显高于HCT116vector细胞克隆(p<0.001)；在奥沙利铂作用下,HCT116CD24细胞克隆中细胞活性也明显高于HCT116vector细胞克隆(p<0.001)。提示CD24过表达可以增强肿瘤细胞对5-FU和奥沙利铂的抵抗性。4.在无血清培养体系中,CD24提高了结肠肿瘤干细胞球mammosphere形成比例在无血清培养体系中,肿瘤干细胞可以形成悬浮"mammosphere",反映了肿瘤干细胞的自我更新能力。无血清体系中包含了DMEM/F12培养基、B27(1:50),20ng/mlFGF-2以及60ng/mlEGF。培养15天后,细胞不再贴壁生长,而是聚集成球悬浮成长。在HCT116CD24组,1000个细胞可以形成约207±11个而HCT116vector组中,1000个细胞则仅能形成26±5个,两组之间有显著差异(p<0.001)。5.上调CD24表达增强CD133-细胞对5-FU和奥沙利铂抵抗性采用免疫磁珠分离方法,结合CD133偶联磁珠分离CD133+和CD133-细胞,并且分别转染pcDNA3.1(+)-CD24及pcDNA3.1(+)-vector,分别建立并命名为CD133+/CD24, CD133+/vector, CD133-/CD24和CD133-/vector四组稳定细胞克隆。分别选择不同药物浓度的5-FU (0,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,250μg/ml, 500μg/ml)或奥沙利铂(0,5μM,10μM,20μM,50μM,100μM)处理48小时后,采用CCK-8检测细胞活性。对于5-FU处理,CD133+／CD24与CD133+/vector之间细胞活性无明显差异(p>0.05)；而CD133-/CD24和CD133-/vector之间细胞活性有明显差异(p<0.001)；此外,CD133-/vector与CD133+/CD24和CD133+/vector之间细胞活性明显下降(p<0.05)。对于奥沙利铂处理后细胞,CD133-/CD24细胞活性明显高于CD133-/vector (p<0.05);而CD133+/CD24与CD133+/vector之间细胞活性也无明显差异(p>0.05)。提示CD24表达升高仅改变了CD133-细胞对化疗药物的敏感性,对CD133+细胞无明显影响。6.CD24促进了CD133-细胞中DNA合成能力BrdU作为干细胞DNA合成标记,也能反映了肿瘤干细胞的比例以及自我更新能力,故本研究采用流式细胞术分析各组细胞中BrdU表达。结果表明：在CD133+/CD24与CD133+/vector两组细胞中,BrdU表达水平无明显差异(98.05±1.3%vs 97.75±1.3%,p=0.731)；但在CD133-/CD24和CD133-/vector组之间BrdU表达水平明显差异(27±3.4%Vs.3±0.25%,p<0.001)。提示上调CD24表达后,促使CD133-细胞中有部分细胞获得了结肠肿瘤干细胞特性,而对CD133+细胞无明显影响。7.上调CD24表达提高CD133-细胞形成mammosphere的能力在CD133-/CD24组中,1000个细胞在无血清培养体系下可以形成约140±15个mammospheres;但在CD133-/vector组中,1000个细胞仅能形成20±4个mammospheres,两者之间有显著差异(p<0001)。而在CD133+／CD24与CD133+／vector两组中,形成mammosphere的个数没有明显差异(p=0.745)。提示CD24促进肿瘤干细胞的自我更新能力主要是通过促使部分CD133-细胞获得肿瘤干细胞的自我更新能力实现的,而对CD133+细胞的自我更新能力无明显影响。8.上调CD24表达增强CD133-细胞在裸鼠体内的致瘤能力将1x106个CD133-/vector和CD133-／CD24细胞分别接种于5周左右的裸鼠背侧皮下,每隔3天测量成瘤体积大小,在30天时处死全部实验裸鼠,取出肿瘤后石蜡包埋、切片用于HE染色,从而鉴定肿瘤特性。CD133-／CD24组移植瘤体积(n=5)随着时间增加而明显增大；但对照组,瘤体体积小,并且增长速度缓慢,两者之间比较有显著性差异(p<0.001)。结果说明了CD24促进了CD133-细胞在裸鼠体内形成瘤体的能力,尽管CD133-/vector细胞中也可形成瘤体,但体积小,而且生长速度缓慢,这可能与采用免疫磁珠分离方法不能完全分离CD133-细胞,在CD133-细胞中存在少量的CD133+细胞。9.沉默CD24表达诱导结肠肿瘤干细胞凋亡我们构建了CD24shRNA慢病毒载体,在无血清培养基体系中,利用lipofectaminTM 2000转染CD133+细胞48小时后,采用Hoechst 33342对细胞染色,干扰组lenti-CD24 shRNA组细胞出现明显凋亡,凋亡细胞出现核浓缩,染色增强；同时悬浮细胞数目减少,部分细胞出现脆裂细胞核沉淀于培养皿底部。进一步采用了流式细胞术Annexin V-7AAD双染检测细胞凋亡,结果与染色结果相似,对照组lenti-vector细胞凋亡比例为2.5±0.65%,而lenti-CD24 shRNA组为27+1.4%,两组之间有显著性差异(p<0001)。上述结果表明了在结肠肿瘤干细胞中沉默CD24表达导致了肿瘤干细胞凋亡10.沉默CD24表达可以减少结肠肿瘤干细胞mammosphere形成在无血清培养体系中,100个CD133+细胞经过scramble shRNA处理后可以形成大约65+3个mammospheres,但是经过沉默CD24表达后,100个细胞形成nammosphere数目仅为8±2个,两组之间有显著性差异(p<0001)。结果表明在结肠肿瘤CD133+细胞中,沉默CD24表达会导致结肠肿瘤干细胞自我更新能力下降,并且降低了肿瘤干细胞mammosphere形成能力。11.沉默CD24表达诱导结肠肿瘤干细胞分化转染lenti-CD24 shRNA或lenti-vector进入无血清培养基中形成的mammosphere中,并进行形态学观察。在lenti-vector组中nammoshere没有明显形态变化,而lenti-CD24 shRNA组中部分mammosphere不再保持原有悬浮球状,逐渐出现分化贴壁,细胞变为长梭状。继而采用细胞免疫荧光染色方法证实了在lenti-CD24 shRNA组中细胞分化标志CD20表达增高,而在lenti-vector表达阴性；OCT-4(调节胚胎干细胞和多种肿瘤干细胞的转录因子)表达却正好相反,在mammosphere中高表达,而在lenti-CD24 shRNA组中表达阴性。提示CD24表达下调可以促进结肠肿瘤干细胞分化,其分子机制可能是通过调节CK20表达和OCT-4表达而改变了肿瘤干细胞特性。12.沉默CD24表达增强了结肠肿瘤干细胞对化疗药物敏感性细胞分组情况：采用lipofectaminTM 2000转染lenti-vector进入CD133+细胞作为对照组(lenti-vector);干扰组转染leitiviral CD24 shRNA (lenti-CD24 shRNA);采用lipofectaminTM 2000转染对应体积的PBS作为未处理组。CCK-8检测细胞活性。相对于未处理组,lenti-vector对照组以及lenti-vector+5-FU (500μg/ml)+奥沙利铂(100μM),这三组之间细胞活性没有明显差异；而lenti-CD24 shRNA组中细胞活性显著低于lenti-vector对照组(51.7±3.4% Vs91.5±1.5%,p<0.001)：与lenti-CD24 shRNA+lenti-vector+5-FU (500μg/ml)+奥沙利铂(100μM)相比较,lenti-CD24 shRNA组中细胞活性明显升高(51.7±3.4%Vs 30.6±2.23%,p<0.001)。结果表明在结肠肿瘤干细胞中沉默CD24表达不仅可以导致肿瘤干细胞活性降低,而且可以增强其对化疗药物敏感性,协同化疗药物的治疗效果。13.沉默CD24表达阻滞了肿瘤干细胞在裸鼠体内成瘤将1000个结肠肿瘤干细胞mammospheres种植入5周龄左右雌性裸鼠背侧皮下,共15只；当肿瘤生长到15天时,所有成瘤体积大小无明显差异,随机将裸鼠分成3组：无处理组(untreated), lenti-vector组以及lenti-CD24 shRNA,每组5只。Lenti-CD24 shRNA组和lenti-vector组分别瘤体内注射1×103TU／g的lenti-CD24 shRNA和对照lenti-vector,未处理组用等量PBS代替；第22天后再注射同样剂量,最后在第30天处死全部裸鼠,取出肿瘤组织并提取蛋白和用10%福尔马林固定。结果发现注射lenti-CD24 shRNA病毒载体的移植瘤随着时间变化,肿瘤体积改变明显低于未处理组和对照组(p<0.001；p<0.001)；而对照组和未处理组之间肿瘤体积没有明显差别(p=0.306)。我们也检测了移植瘤中CD24和CD133表达水平,与细胞内实验结果相符,CD24和CD133表达水平在lenti-CD24 shRNA病毒载体后明显降低。14. CD24和CD133共同表达与结直结肠肿瘤转移、分化及生存率相关为了进一步证实CD24和CD133共同表达与结肠肿瘤患者临床病理学特征之间的关系,我们采用免疫组织化学的方法检测了213例术后结肠肿瘤患者肿瘤组织中CD24和CD133表达,结果显示在结肠肿瘤患者组织中CD24与CD133表达显著相关(r=0.658,p=0.000)；CD24和CD133共同表达与结肠肿瘤患者低分化,淋巴结转移以及远处转移有关,而与性别、年龄、肿瘤分期和生长部位无关。分析其中89例患者100个月的随访资料,CD24和CD133共同表达组100个月的生存率明显低于CD24和CD133共同阴性组(p=0.01)。结论综合以上研究结果,我们可以得出以下结论：1.CD24过表达可以上调结肠肿瘤细胞中CD133的表达,增强结肠肿瘤细胞对化疗药物抵抗性；2.CD24过表达可以增强结肠肿瘤肿瘤干细胞自我更新的能力；3.CD24过表达可以促使CD133-细胞获得结肠肿瘤干细胞的特性；4.沉默CD24表达可以促进结肠肿瘤干细胞凋亡,降低其对化疗药物抵抗性,阻滞细胞体内成瘤能力；5.CD24和CD133共同表达与结肠肿瘤转移、分化及生存率相关。因此,我们研究CD24是结肠肿瘤干细胞自我更新、化疗药物抵抗,分化以及成瘤的一个重要调节基因,沉默CD24表达可以有效“杀死”结肠肿瘤干细胞。检测CD24和CD133共同表达可以预测结肠肿瘤患者的生存率。所以CD24可以作为一个有效的结肠肿瘤干细胞治疗的靶标,为针对结肠肿瘤的新的生物治疗药物开发提供了有力的理论依据。