锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus, KHV),即鲤科疱疹病毒3(Cyprinid herpesvirus3, CyHV-3),是一种双链、线性DNA病毒。锦鲤疱疹病毒是近年来在锦鲤和普通鲤鱼中发现的一种新病毒,它传染性强,死亡率高,呈世界性分布和流行,给鲤鱼和锦鲤养殖业造成了很大的经济损失,被列为我国二类动物疾病。目前的流行病学研究表明,鲤疱疹病毒传播迅速,水温22-27℃时爆发,死亡率高达80%-100%。由于该病毒造成病鱼的死亡率极高,疫情难以控制,已引起各国的高度关注。本研究建立了锦鲤尾鳍细胞系,通过染色体数目、核型以及DNA含量等实验,发现体细胞和培养细胞无显著性差异,染色体数目和DNA含量符合比例关系,建立的锦鲤尾鳍细胞系已形成了稳定的遗传性状,命名为KF-h。将感染病毒的鲤鱼肾细胞悬液接种于KF-h细胞单层,出现典型的KHV CPE现象,通过电镜观察、PCR扩增和序列分析以及动物回归试验,表明已成功分离到KHV病毒,命名为KHV-hlj。锦鲤疱疹病毒KHV-hlj株经过灭活制成细胞灭活疫苗,鲤鱼经注射和浸泡免疫细胞灭活疫苗后,通过对其白细胞吞噬能力、淋巴细胞转化能力的检测以及攻毒试验证明,非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均显著提高；此外,这种制备方法能有效保留病毒致病性抗原的完整性,完整的病毒抗原有效地刺激鲤鱼产生较强的免疫反应,最终导致了受疫鲤产生较强的免疫保护力。锦鲤疱疹病毒KHV-hlj株,菌株自细胞系提取,KHV-hlj株细胞灭活疫苗,配方合理,操作简便,价格适中,适于批量生产,使疫苗的推广应用成为可能。疫苗的免疫结果表明,通过注射途径接种疫苗,比浸泡获得更高的凝聚抗体效价和免疫保护率。实验扩增了锦鲤疱疹病毒包膜糖蛋白gD基因,序列测定表明了包膜糖蛋白gD基因具有高度的遗传稳定性,核酸序列同源性达99.64%,主要功能区的序列未发生变化,对gD蛋白的功能和结构没有影响。锦鲤疱疹病毒KHV包膜糖蛋白gD基因的全长1179bp,编码393个氨基酸,25个疏水氨基酸的氨基末端信号肽,成熟肽只有368个氨基酸。KHV-gD蛋白是跨膜糖蛋白,跨膜螺旋区位于N端4-25位和C端341-363位之间,其大部分肽链位于膜外区,只有小部分在胞内。克隆的KHV-gD在去除了N端的前25个氨基酸(信号肽)后,为该蛋白的成熟肽,序列分析表明其有34个碱性氨基酸,35个酸性氨基酸,130个疏水氨基酸,92个极性氨基酸,分子量为40.63kD,等电点pI为7.15; KHV-gD成熟肽与KHV-gD相比,C端跨膜螺旋的结合分值有所升高(从2217升高至2777)。本研究构建了含完整KHV-g基因的巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K-KHV-gD,在酵母菌中表达KHV-gD蛋白时,可保证KHV-gD免疫原性的完整,为研制重组蛋白诊断试剂盒及开发基因工程疫苗奠定了基础。此外,也为研究KHV-gD蛋白的结构和功能提供了有利条件。