银屑病是一种增生性、炎症性、慢性皮肤疾病,此病发生率高且极易复发,目前该疾病的发病机制仍不完全明确。银屑病存在发病周期长、治愈难度高等特征,使患者精神及身体皆承受压力和痛苦,明显干扰到患者的日常生活与工作,故此病被视为当前皮肤科领域内重点研究的疾病之一。目前,银屑病治疗药物主要包括甲氨蝶呤、地塞米松、维A酸类、维生素(Vit)D3类似物与糖皮质激素等,还有部分生物制剂,如依那西普等也用于此病的治疗,但这些药物及治疗手段均存在一些治疗局限性及不同程度的毒副作用,因此迫切需要开发更有效、更安全的银屑病治疗药物。1.抑制HaCaT细胞活力的化合物的筛选在本研究中,我们首先利用银屑病相关的细胞模型-人角质形成细胞HaCaT,对250余种传统中药化合物进行筛选,发现杠柳苷元能够显著抑制HaCaT细胞的活力,但在所用的剂量范围内对人成纤维细胞Hs-68的活力几乎无影响,提示杠柳苷元可能具有作为银屑病治疗候选药物的潜力。为了获得抑制HaCaT细胞活力的高效低毒的化合物,我们检测了6种杠柳苷元结构类似物对HaCaT细胞活力的影响,最后选取了对HaCaT细胞抑制作用较强,但对正常Hs-68细胞低毒的杠柳苷元结构类似物铃兰毒苷作为后续研究的化合物,并将其与杠柳苷元的活性进行了对比研究。2.杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷抑制HaCaT细胞活力的机制研究根据已有文献报道,银屑病皮损部位可观察到角质形成细胞(keratinocytes,KC)具有很强的生长、增殖和分化能力,并且凋亡受到抑制。因此,在探究杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷抑制HaCaT细胞活力的机制时,我们首先检测了杠柳苷元和铃兰毒苷对HaCaT细胞增殖的影响。研究结果显示,杠柳苷元或铃兰毒苷可通过抑制DNA合成,降低Ki67、cyclin D1和cyclin E蛋白表达水平以及增加p21蛋白表达,诱导HaCaT细胞G1/S期细胞周期阻滞,从而抑制其增殖。随后,我们通过检测杠柳苷元或铃兰毒苷处理后HaCaT细胞的形态学变化、凋亡相关蛋白casapase-3的激活情况、细胞凋亡率及凋亡抑制剂z-VAD-fmk的抑制效果,分析杠柳苷元及铃兰毒苷对HaCaT细胞凋亡的影响。结果显示,杠柳苷元或铃兰毒苷处理后的HaCaT细胞并未表现出明显的凋亡特征。但在通过DAPI染色观察HaCaT细胞形态时发现,经杠柳苷元或铃兰毒苷处理后的HaCaT细胞其细胞核稀疏成网状,染色质向边缘聚集、细胞肿胀最终破裂。这一形态学变化与细胞坏死的特征相似,暗示杠柳苷元或铃兰毒苷可能诱导HaCaT细胞发生坏死。随后,PI染色及细胞培养液中LDH释放检测结果表明,杠柳苷元或铃兰毒苷的作用使得HaCaT细胞的细胞膜失去完整性。此外,杠柳苷元或铃兰毒苷还可使HaCaT细胞的ATP水平下降,促进细胞坏死。透射电镜也可清楚地观察到两种化合物处理后的细胞出现细胞坏死的典型特征。同时,程序性坏死抑制剂Nec-1能够有效阻断杠柳苷元或铃兰毒苷对细胞活力的抑制作用,证实了杠柳苷元或铃兰毒苷确实是通过诱导HaCaT细胞发生程序性坏死从而抑制细胞活力的。进一步探索发生细胞程序性坏死的机制,发现在杠柳苷元或铃兰毒苷作用后的HaCaT细胞中ROS表达水平升高,而活性氧清除剂NAC、NADPH氧化酶抑制剂apocynin和程序性坏死抑制剂Nec-1均能抑制ROS的产生,并且NAC和apocynin还能够阻断杠柳苷元或铃兰毒苷诱导的程序性坏死。以上结果表明,杠柳苷元或铃兰毒苷对HaCaT细胞活力的抑制作用是通过抑制HaCaT细胞增殖及诱导细胞发生ROS介导的细胞程序性坏死来实现的。3.杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷对银屑病模型鼠的治疗作用研究前面的结果显示,杠柳苷元和铃兰毒苷在细胞水平表现出明显的抗银屑病作用,为进一步研究两种化合物对银屑病的治疗效果,我们构建了两种诱发性银屑病小鼠模型,诱导剂分别为咪喹莫特(IMQ)和佛波酯(TPA),并探讨了两种化合物对模型鼠银屑病样病变的治疗作用。结果显示,杠柳苷元或铃兰毒苷涂抹治疗可明显缓解由咪喹莫特和佛波酯所诱导的小鼠银屑病样皮肤损伤,并显著减少新生血管的生成、血管周围炎症细胞,如CD4~+T细胞、CD8~+T细胞、CD11b~+/CD11c~+树突状细胞、皮肤淋巴细胞相关抗原CLA~+T细胞和Vγ4~+T细胞的浸润,同时杠柳苷元和铃兰毒苷也下调了相关炎症因子IL-17A、IL-17F、IL-22、TNF-α、IFN-γ的表达水平。综上所述,我们的研究发现,杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷可通过抑制皮肤角质形成细胞的增殖和诱导其发生细胞程序性坏死、抑制免疫细胞浸润和炎症因子的异常表达来改善银屑病小鼠的皮肤损伤,从而缓解银屑病的症状。本研究从细胞和动物模型的水平揭示了两种高效低毒天然化合物的抗银屑病效果,为研发新一代银屑病治疗药物提供了新的先导化合物。